不孕症的檢查與診斷《十二》

第12節　免疫學檢查 免疫不育包括男性抗精子自身免疫不育－女性抗精子同種免疫不育的女性抗透明帶免疫不育。 一、抗精子免疫不育的檢查 抗精子免疫抗精子體液免疫（抗精子抗體）和抗精子細胞免疫。（一）抗精子抗體的檢測 1.後試驗　于後6-24h内取宮頸粘液，在高倍鏡下觀察計數精子數。每高倍視野中，有gt;=21條檢度活潑的精子者爲比較好，有6-20條很活潑的精子爲良好，有1-5條活動精子屬尚好，有少數不活動精子爲較差，無精子者爲陰性。 實驗受測試夫婦心理和情緒情況及宮頸粘液中的理化特征等非免疫性因素的影響，可作爲檢測生殖道局部抗精子抗體的初篩手段。 2.精子-宮頸粘液接觸或穿透試驗（SCMC或s-c　MPT）SCMC是将與排卵前宮頸粘液混合孵育，鏡下觀察精子震顫現象，gt;50%爲陽性，提示可能有局部抗精子抗體存在，s-c　MPT是将宮頸粘液裝于毛細血管中，開口端加孵育後鏡下觀察5個以上活精子到達的最遠距離，lt;20mm爲穿透不良，gt;20mm爲穿透良好。本試驗可受非免疫因素影響，如精子的活力、宮頸粘液的理化性質等。 3.精子凝集試驗　精子抗原與抗體結合後可發生凝集反應，凝集反應是抗原與特異性抗體反應的傳統及敏感的方法，通過肉眼或顯微鏡觀察結果。檢測方法包括下列幾種。（1）明膠凝集試驗（GAT）：适當稀釋的精子懸液與10%明膠溶液混合後加入待測血清孵育，2h後若出現絮狀物爲陽性。此法簡便，每次設陰性及陽性對照組，則結果較可靠。（2）試管玻片凝集試驗（TSAT）：按要求稀釋的精子懸液與待測血清孵育2-4h後，鏡下觀察gt;=10%凝集爲陽性。此法能觀察凝集類型，方法簡便，但可受多種因素幹擾，如微生物、組織碎片，血中雄激素升高，均可發生非特異性凝集。每次試驗需設對照組。（3）淺盤凝集試驗（TAT）：使用特制淺盤，隻需檢測樣本幾微升（ul），在倒置顯微鏡下觀察gt;=10%凝集爲陽性。此法所用樣本較TSAT少，可同時檢測較多的血清樣本，較GAT敏感，亦少受非特異性因素幹擾。若血清效價gt;=1：32，則可認爲确含精子抗體。 其他尚有毛細管凝集法及平闆凝集法，較少用。 4.補體依賴性細胞毒試驗及精子制動試驗　精子抗體與精子抗原結合，激活補體系統，導緻細胞膜通透性及完整性的損害，若爲制動抗體，使精子失去活力，制動值gt;=2爲陽性；若爲細胞毒抗體，則用某些染料染色陽性，要求精子活率gt;70%。微量法僅需樣本幾微升，對精子活動率較低的樣本，可用上遊法提取活精子，活率可達90%以上。本法僅能檢測作用于精子尾幹的抗體。特異性強，敏感性差，假陰性率較高。 5.被動血凝法　用精子提取物及精漿包被經處理的紅細胞使之緻敏，将緻每紅細胞與待測稀釋血清在微量反應闆上進行反應，出現紅細胞凝集爲陽性。此法不受精子活率、計數、中微生物或組織碎片的影響，研究者認爲此法特異、敏感，但報道較少，其可靠性及實用性尚待證實。 6.酶聯免疫吸附試驗（ELISA）及生物素-親合素酶聯免疫吸附法（BA-ELISA）應用完整精子或精子膜抗原包被固相載體，待測樣本中精子抗體與之培養後可結合于抗原表面。随之酶标第二抗體亦可結合其表面，後經加酶底物，根據底物顯況判斷結果。可用肉眼觀察，亦可用酶标儀測定，後者客觀準确，一般以大于一組陰性血清光密度均值加2倍标準爲陽性。由于完整精子包被易緻非特異性吸附，因此若以可溶性精子膜抗原包被，則本法敏感、特異、客觀、定量，能确定抗體類型，且易操作。BA-ELISA是在常規ELISA基礎上發展起來的新一代定量檢測法，其敏感法性、特異性超過常規法。 7.免疫珠試驗（Immunbead Test,IBT） 用抗人免疫球蛋白抗體包被的聚丙烯酰胺微能結合于結合了精子抗體的精子表面，在相差顯微鏡或電子顯微鏡下可見到免疫珠随精子運行，若結合一個或多個免疫珠的精子比例gt;=10%爲陽性。此法可确定抗體的部位、類型及結合精子的比例，能測出活精子表面結合的抗體。其敏感性、特異性及重複性較好，操作稍繁瑣，檢測所需樣本少，可用于宮頸粘液、輸卵管液等微量樣本的檢測。 8.放射性标記免疫球蛋白或A蛋白法　同位素标記的抗人免疫球蛋白或葡萄球菌A蛋白與結合在精子表面的精子抗體結合，用X計數器測定精子表面的放射活性。若以活精子作爲抗原其特異性及敏感性較高，且可确定抗體類型。但由于每次實驗活動精子來源不同，其結果重複性較差；且設備昂貴，操作者易受放射性損害，故此法報道較少。 9.間接免疫熒光試驗　精子表面結合于抗原後，能與标有熒光素的第二抗體結合，在熒光顯微鏡下觀察呈現熒光的陽性精子比例。因試驗中需要甲醇固定緻精子膜損傷，内部抗原外露，而抗内部抗原的抗體在正常人中普遍存在，故假陽性太，無臨床實用價值。近年來，作液相培養，實驗過程中無需固定，又重新确定了本法的使用價值。 10.精卵相互俢直接檢查法（1）精子-透明帶結合或穿透試驗：自腹腔鏡檢查中獲得的人卵與精子在一定條件下孵育後，觀察精子能否穿過透明帶進入細胞周圍的空間，若精子不能穿過透明帶，考慮有制動抗體存在，此試驗亦受其它因素幹擾。（2）精子-去透明倉鼠卵穿透試驗（SPA）：将優化提取的的活精子與無帶倉鼠卵混合孵育，在相差顯微鏡下觀察，若卵内含腫脹精子頭（帶尾）爲已經穿透。SPA可用于判定：①有精漿抗體的精子的受精能力；②各種抗體在阻止受孕時的重要性。此試驗也可受多種因素影響。（二）抗精子細胞免疫的檢測 對細胞介導的抗精子免疫的研究資料較少，各家結論不一。動物實驗及人體檢測表明，抗精子細胞免疫可可甬不育的原因之一。 檢測細胞介導抗精子免疫反應的試驗主要有淋巴細胞轉化試驗、白細胞粘附抑制試驗、白細胞或巨噬細胞移動抑制試驗、皮膚試驗及外周血白細胞促凝血活性法等。所采用的抗原不一，有新鮮洗滌精子、凍融精子、半純化精子等。目前，因使用的抗原不統一，檢測方法各異，研究倒數較少，各種方法的特異性尚難評價，其結果亦難于比較。 二、抗透明帶免疫性不孕症的檢測 人卵透明帶來源有限，很難獲取，但人透明帶與豬透明帶間有交叉抗原性，因此實際工作均用豬透明帶代替人卵透明帶用于檢測人血清中透明帶抗體。由于部分正常粉血清中存在異種凝集素（主要爲IgM）幹擾實驗結果，因此檢測前需用新鮮豬紅細胞待測血清。 1.透明帶沉澱反應　透明帶表面結合抗體後，在光鏡或暗視野鏡下呈現折光改變。本法多用于鑒定血清、敏感性低，難用于臨床。 2.放射免疫法　用放射性标記的豬透明帶抗原與待血清培養後，分離出抗原體複全物，測定其放射性。本法能定量，特異性及敏感性較好，但由于放射性損害，且報道不多，故本法尚難肯定。 3.間接免疫熒光試驗　人抗透明帶抗體結合至豬卵表面後，标有熒光素的抗人免疫球蛋白抗體随之結合至透明帶表面，在熒光顯微鏡呈現明顯的卵周熒光。本法的可靠性有賴于其它客觀方法證實。 4.ELISA及BA－ELISA法　以豬透明帶抗原包被固相載體，另加待測血清、酶标第二抗體及底物，分步培養洗滌，最後根據底物顔色變化情況判斷情況。本法所需樣本量少，無需特殊設備，操作簡便，能定量測定抗體并确定抗體類型，特異性及敏感性較好。BA－ELISA具有常規ELISA的優點，而其敏感性大爲提高。 5.被動血凝法　用純化的豬透明帶抗原包被其他物種的紅細胞爲抗原靶标，在存在透明帶抗體的情況下，緻敏紅細胞發生凝集。此法研究報道較少，難以評價其敏感性和特異性。 6.精子－透明帶結合或穿透試驗　若存在透明帶抗體或抗精子抗體，此法均可陽性。由于試驗受培養環境因素影響較大，故對不同實驗室的研究結果難以比較。此法可與其它方法配合應用，相互補充，以保證結果的可靠性。