肝纖維化模型

   【摘要】 肝纖維化是多種慢性肝病發展至肝硬化的共同病理學基礎，雖然對肝纖維化的研究已從細胞水平進入分子水平，但肝纖維化動物模型的建立，仍是臨床研究和實驗研究的重點和難點。本文就數種肝纖維化模型的建立方法加以綜述，并對各種模型的優、缺點和各自用途進行比較，提出了肝纖維化動物模型的研究方向。

    【關鍵詞】 肝纖維化 模型 動物

    肝纖維化是各型病毒性肝炎和某些肝病的病理特征，是慢性肝炎發展爲肝硬化的必經階段。目前，普遍認爲，此階段病理過程可逆。尋找有效藥物阻斷肝纖維化的發生和發展，是國内外研究的熱點。建立合适的肝纖維化動物模型，是研究肝纖維化發生機制、篩選護肝藥物的前提。近年來，肝纖維化動物模型研究取得了可喜的成就。現将其研究進展綜述如下。

     1 化學藥物或毒物所緻肝纖維化實驗動物模型

    肝細胞對許多化學藥物或毒物敏感，通過化學藥物或毒物對實驗動物造成不同程度、不同性質的肝損傷模型是最常用的方法。

    1.1 四氯化碳中毒性肝纖維化動物模型 它是最早、最廣泛應用、最能誘導肝纖維化動物模型的化學毒物。高濃度的CCl4主要累及中樞神經系統，而低濃度長期反複染毒則易損害肝、腎。其作用機理是：在肝細胞内質網中，CCl4通過肝微粒體細胞色素P450氧化酶激活後生成三氯化碳(-CCl3)，CCl3與肝細胞内大分子發生共價結合，破壞肝細胞功能。此外，CCl3還可攻擊肝細胞膜的磷脂，引起脂質過氧化破壞膜性結構，損傷肝細胞，從而導緻狄氏間隙内原本靜止的貯脂細胞活化，釋放IV型膠原酶，降解IV型膠原。肝細胞從合成分泌IV型膠原爲合成分泌I型膠原，取代了IV型膠原，促使肝髒纖維化[1]。造膜途徑多樣化，形成肝纖維化模型時間也與給藥途徑不同而有差異，時間6～16周不等。王曉紅等[2]給大鼠皮射60%CCl4植物油溶液0.3ml/100g，2次/周，發現大鼠肝髒炎症和纖維組織增生程度随實驗時間延長逐漸加重，20周後正常肝小葉結構消失，假小葉形成。郭美姿等[3]用60%CCl4植物油液給大鼠灌胃。首次0.5ml/100g，以後0.2ml/100g，2次/周，共6周，同時給與5%乙醇。見廣泛肝細胞變性壞死，纖維組織明顯增生，形成假小葉。Montfort et al[4]取Wistar大鼠，用濃度40%CCl4，按2ml/kg體重給予大鼠腹腔注射，每周2次，共8周，見肝小葉間結締組織明顯增多，出現由再生肝細胞形成的假小葉。用CCl4攻擊建立的肝纖維化模型，具有簡便、易行、價廉且耗時短的特點。在形态學、病理生理學的某些方面與人肝纖維化相似，已廣泛用于研究肝纖維化發生的細胞及分子機制、血清學标志物與組織病理的相關性及抗纖維化的藥效評價，但有死亡率高，停止造膜給藥後，有一定自然恢複趨勢的特點。

    1.2 緻癌物緻肝纖維化動物模型 低劑量長期應用緻癌物可引起肝纖維化，常用二甲基亞硝胺(DMN)、硫代乙酰胺(TAA)等。DMN通過肝微粒體代謝其中間産物與核酸、蛋白質等結合導緻肝細胞損傷，同時産生的活性甲基化産物使核酸、蛋白甲基化導緻肝壞死[5]。TAA通過影響蛋白合成及肝細胞中酶的代謝誘導肝損傷。李春輝等[6]給雄性Wistar大鼠腹腔注射DMN(10μl/kg)，每周注射3天，4周後肝廣泛纖維化。張傑等[7]給大鼠0.03%的TAA誘導5周，再改爲0.04%TAA誘導飼喂5周，10周後間肝内假小葉廣泛形成。該模型簡單可靠，造模時間短，肝纖維化模型成功率高且形成相對穩定，在組織學和生化代謝的變化上與各種病因引起的人類肝硬化改變很相似，該模型實用于肝纖維化發生機制的研究及肝硬化向肝癌轉化的機理研究。但DMN、TAA的毒性大，易揮發，實驗操作過程中應加強個人防護。

     2 慢性酒精中毒性肝纖維化動物模型

    酗酒是當今世界的嚴重問題，它不僅造成各種社會危害，還可引起酒精性肝病。酒精引起肝纖維化的主要機制是：進入肝内的酒精在乙醇脫氫酶和微粒體乙醇氧化酶系的作用下轉變爲乙醛，再轉變爲乙酸。後一反應使輔酶I(NAD)轉變爲還原型輔酶I(NADH)，導緻NADH對NAD比值增高的效應，從而抑制肝線粒體三羧酸循環[8]，進而脂肪氧化減弱，肝内脂肪酸合成增加，當其增多超過肝髒的處理能力就形成脂肪肝，最終形成肝纖維化。周甯等[9]給大鼠按每周所測得的體重給與酒精體液分數爲0.56的白酒7g/kg灌胃，每日晨1次，持續24周。實驗期間均予全價營養顆粒飼料喂養，自由進食進水。4周出現中央靜脈壁周圍膠原稍增多，窦周纖維化，24周肝小葉内出現纖維分隔。實驗結果表明，大鼠肝纖維化程度與實驗時間長短成正比。該模型科學可行且死亡率低(18.18%)，一般用于酒精性肝病的研究。

     3 營養不良性肝纖維化動物模型

    該模型是通過膳食不平衡或特種營養素缺乏引起動物肝脂變漸漸形成肝纖維化。如高脂低蛋白低膽堿性膳食，胱氨酸、維生素E缺乏或加入乙硫氨酸等。用缺乏膽堿和蛋氨酸低蛋白高脂飼料喂養幼年大鼠可造成脂肪代謝障礙，3個月可發展爲脂肪性肝纖維化，并且與人酒精性肝纖維化相似。該模型适合研究飲食脂肪含量與膽堿缺乏和肝纖維化的關系。

     4 實驗性免疫建立肝纖維化模型

    該模型形成機制是免疫複合物所緻的Ⅲ型變态反應。主要在肝髒門脈彙管區形成免疫複合物沉積，由沉積的免疫複合物引起局部炎症反應，進一步刺激膠原的增生而造成肝纖維化。董忠[10]等通過腹腔注射人血清白蛋白建立免疫損傷性大鼠肝纖維化模型，給雄性大鼠(體重110～120g)皮下多點注射人血清白蛋白(共4次)，10天後腹腔注射人血清白蛋白(每周2次，共8周，劑量從5mg逐漸增至20mg)，可見肝組織界闆區肝細胞變性，壞死，炎性細胞浸潤，彙管區及小葉間纖維組織增生，纖維化模型形成率100%，持續時間120天以上。此外，還可采用動物血清白蛋白如牛血清白蛋白緻免疫損傷性肝纖維化動物模型[11]。由于此類模型是一種免疫性損傷，造成的肝纖維化與臨床上的慢性肝炎所緻肝纖維化在發生機制上更加接近，爲一種理想的模型。在研究肝纖維化發生機制、早期診斷以及評價藥物療效等方面應用較多。

     5 膽管阻塞性肝纖維化模型(BCM)

    BCM在大鼠、兔、犬和猴等動物取得成功。該法是通過切斷膽管或注入硬化劑等方法造成肝外膽道梗阻，引起梗阻以上膽汁淤積，肝内血管受壓，肝細胞缺血壞死，纖維組織增生向膽管伸展，包繞肝小葉，形成肝纖維化。造膜方法簡單，周期短。大鼠6周左右即可形成肝纖維化。尹珊珊等[12]随機予大鼠進行單純膽管結紮、膽管結紮與切斷、及膽管内逆行性注入TH膠加膽管結紮造成膽管阻塞的結果表明：後一種方法較前兩種方法更穩定，表現在術後2周時，單純結紮的大鼠全部膽管再通，6周時，膽管粘堵組膽管再通的大鼠明顯少于膽管切斷組。此模型纖維化形成快，4周時可見圍繞增生的膽小管周圍增生的纖維組織分割肝小葉，另外，炎症反應輕，肝細胞壞死不明顯。阻塞後16周，病理組織學上仍可見明顯的纖維化，且肝纖維化的進展與血清中酸性前膠原蛋白的增加相關性明顯，可作爲肝纖維化生物指标測量的理想模型。

     6 病證結合肝纖維化動物模型

    病證結合是中西醫結合的重要環節，既辨證又辨病，病證結合中西醫結合動物模型對臨床病理研究與中醫證候本質研究具有一定參考價值[13]，尤其對中醫藥防治疾病研究可提供客觀療效判定和用于探讨藥理作用。

    6.1 血吸蟲病蠱脹模型 郭振球等[14]經小白鼠腹部皮膚人工感染日本血吸蟲尾蚴10條，第七周用吡蝰酮全劑量殺蟲，制成模型。肉眼看腹部腫大，青筋顯露，腹壁靜脈充血，打開腹腔後，有少量腹水，肝脾明顯腫大，肝髒呈紫色，包膜充血，顔色紫暗，肝髒表面布滿灰白色粟粒樣結節。鏡下脾髓索内有嗜酸性細胞浸潤，肝髒彙管區有蟲卵結節及纖維結締組織增生，肝組織淋巴細胞、單核細胞及嗜酸性白細胞浸潤。此模型既具備肝纖維化病理特征，又符合中醫蟲瘀證候表現，病證結合得到很好的體現。可用來進行中醫藥治療蠱脹的藥效學及病因病機研究，有較好的應用前景。

    6.2 血瘀型肝纖維化大鼠模型建立 張斌等[15]采用複合多因素的建模方法，在二甲基亞硝胺(DMN)制作大鼠肝纖維化模型的同時，多次靜脈給予去甲腎上腺素和小牛血清白蛋白綜合造模。造膜結束時血瘀組大鼠出現明顯血瘀證候，表現爲舌質青紫瘀斑，舌下靜脈曲張，體重減輕，毛發無光澤易脫落、易激惹、抑郁等情緒異常表現，極好地模拟了臨床上肝病患者肝郁的特征。肝髒病理學觀察表明，血瘀組肝纖維組織增生，纖維間隔加寬，肝窦明顯擴張瘀血，出現典型的肝纖維化。本研究采用多因素方法成功複制了血瘀型肝纖維化病證結合動物模型，模型既具備肝纖維化病理特征，又符合中醫血瘀證證候表現。此模型可用于血瘀證實質的探讨及活血化瘀方藥作用的研究[16]。除了以上這些造模外，多因素緻動物肝纖維化造模是目前常用方法，可節約時間，提高成功率與降低死亡率。如CCl4加乙醇[17]，CCl4加人造血清白蛋白[18]。綜上所述，我們需要根據不同的實驗目的和需要來選擇最适合的肝纖維化動物模型。但理想的纖維化動物模型應與人類疾病特征相似，且造膜方法簡單，模型形成率高，重現性好，由于肝纖維化的病因多樣化，動物與人種屬的差異性，迄今爲止，模型制作尚未完全取得成功。所以今後應進一步加強肝纖維化模型的研究。展望未來，我們相信通過設計轉基因制模是發展的趨勢。

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    作者單位：鹽城衛生職業技術學院病理教研室(江蘇)

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