類風濕關節炎的幹細胞移植及基因治療

　　類風濕關節炎(RA)是一種發病機制尚不十分明确的自身免疫性疾病，許多學者認爲T淋巴細胞在RA的異常免疫反應中起主導作用。據統計，RA在我國的發病率爲0.32-0.36%，因此有一個十分龐大的患者群。而目前包括非甾體類抗炎藥、慢作用抗風濕藥甚至新型生物制劑在内的RA的治療方法均無滿意的療效，緻使本病有相當高的緻殘率,給患者本人及整個社會都帶來很大的經濟負擔。近年來文獻報道造血幹細胞移植(hematopoietic stem cell transplantation, HSCT)和基因治療(Gene Therapy)有可能從根本上治愈RA，給RA患者帶來了新的希望。本文對造血幹細胞移植及基因治療的現狀作一概述,并簡要介紹我院在這兩方面所進行的工作，以探索RA治療的新途徑。

　　一、 造血幹細胞移植：
　　
　　造血幹細胞移植傳統上用于治療急性白血病、淋巴瘤等危及生命的疾病。随着技術方法的不斷成熟和安全性的提高，其适應症已擴展至其他疾病，成爲血液系統疾病、實體瘤、自身免疫病(AID)和基因缺陷疾病的重要治療手段。其中，自身免疫性疾病因病程遷延、緻殘率高、患者生活質量差且無理想的治療方法而成爲幹細胞移植治療的一大類疾病。動物實驗已證實，HSCT可從根本上治愈AID；臨床上也有較多資料表明HSCT成爲某些嚴重AID的有效治療手段。HSCT根據幹細胞的來源不同分爲異體HSCT和自體HSCT，盡管已有報道異體HSCT可根治AID，但由于其移植相關死亡率較高，自身免疫性疾病的造血幹細胞移植多采用自體外周血幹細胞移植。截止到2001年5月，在EBMT/EULAR(European Group for Blood and Marrow Transplantation / European League Against Rheumatism)注冊的接受外周血幹細胞移植(PBSCT)的患者已達350例，包括多發性硬化、系統性硬皮病、系統性紅斑狼瘡、幼年特發性關節炎及RA等，其中RA患者有43例。這些接受PBSCT的RA患者有的得到了較長期的完全緩解，也有複發的報道。但無論如何，對于傳統治療方法，甚至最新出現的以腫瘤壞死因子－α(TNF-α)颉颃劑爲代表的生物治療都無反應，病情持續進展的難治性RA來說，HSCT仍是最有希望的治療措施。
　　
　　PBSCT治療RA基于以下三點臨床觀察：1、骨髓摧毀性破壞的RA患者在接受異體骨髓移植後病情得以緩解；2、合并有其他惡性疾病的RA患者接受自體幹細胞移植後病情明顯改善；3、RA并非一良性的緻畸型疾病，其死亡率顯著高于正常人群。由于T細胞介導的異常的自身免疫反應是RA發病的重要因素，因此HSCT治療RA的合理性即在于RA自身免疫的發病機制以及其對免疫抑制劑的治療反應性。目前認爲，HSCT 誘導RA緩解的機理包括以下幾個方面：1、RA的發病需要多種及多亞群的淋巴細胞參與抗原的遞呈、識别和反應，而預處理方案的應用使其功能發生障礙,甚至凋亡, 即摧毀了自我攻擊性淋巴細胞克隆，從而抑制了炎症反應，起到使疾病短期緩解的作用；2、通過去T的HSCT，即回輸給患者高的CD34+細胞，盡可能減少移植物中異常的淋巴細胞克隆，可最大限度地減低T細胞激活所造成的異常免疫功能狀态，減低複發的可能；3、HSCT後免疫重建是疾病長期緩解的基礎[5]。免疫重建一般發生于移植後半年，主要爲細胞免疫的重建，淋巴細胞各亞群的重建不同步，B淋巴細胞約于移植後6-12個月恢複，而T淋巴細胞需1-2年才能恢複正常，如CD4/CD8淋巴細胞比例倒置可持續至移植後兩年。在免疫重建過程中患者的免疫調節可能達到新的平衡或産生免疫耐受，即對自身抗原決定簇産生耐受，從而導緻無反應性和／或自身反應程度的下降，使RA得以治愈。RA患者在接受PBSCT後,已破壞的關節在免疫重建中提供新的抗原,能通過負選擇而産生免疫耐受[6]。但由于RA的病因并不是單因素的，因此APC MHCII基因型、骨髓的微環境及生存的環境未改變,RA仍有複發的可能，HSCT後病情的複發可能還有以下原因：自身攻擊的淋巴細胞克隆繼續存活；自身反應的淋巴細胞克隆再回輸；患者原有自身抗原的持續刺激等。這些問題的解決尚有待于更深更廣的研究。 
　　
　　我院自2001年開展了HSCT治療難治性RA的前瞻性I期臨床研究。選擇藥物治療失敗而無不可逆性内髒功能受損的RA患者作爲研究對象。入選标準包括：年齡≤60歲；患者爲複發性、難治性RA，4種或4種以上的二線藥物治療無效；無嚴重的不可逆的内髒器官受損：(1)心：左室射血分數(EF)≥45％ (2)肺：肺功能檢查示通氣及彌散功能正常 (3)腎：血肌酐(Cr) ≤1.5mg/dl (4)肝：肝功能指标正常 (5)骨髓造血功能正常；簽署知情同意書。技術路線包括造血幹細胞動員、采集、CD34+細胞分選(去T)、幹細胞凍存、預處理及幹細胞回輸。移植後觀察腫痛關節數、關節功能、關節X線檢查等臨床指标的變化，用ACR20、ACR50、ACR70标準對患者的疾病活動程度進行評估。本研究的先進性主要有以下幾點：1、細胞分選技術：患者所回輸的幹細胞均是經過最新的ClinMACS分選技術分選所得的高的CD34+細胞，這一過程中T細胞去除達3-4個對數級，最大限度地減低T細胞激活所造成的異常免疫功能狀态，減低複發率；2、預處理方案：應用目前國際上公認的最佳預處理方案：CTX+ATG，其中CTX用量達200mg/kg，ATG爲90mg/kg。這樣的方案可最大程度上摧毀機體的異常免疫系統，清除自身反應的淋巴細胞；3、淋巴細胞表型分析：在移植前後對患者進行外周血的淋巴細胞表型分析，一方面可了解患者的免疫功能狀态，爲臨床預防和控制感染提供依據，另一方面可監測移植後的免疫重建，了解RA長期緩解過程；4、将動員後獲取的造血幹細胞進行體外培養，在其不同的分化階段檢測其免疫功能，在幹細胞水平探索RA的發病機理。
　　
　　目前我院已完成1例難治性RA患者的幹細胞動員、采集、分選、預處理及回輸等HSCT全過程，至今已随訪10個月，病情平穩。此患者是一位29歲女性，自7年前出現反複多關節腫痛、晨僵及間斷發熱，查類風濕因子(RF)高滴度陽性，血沉(ESR)增快，符合1987年美國風濕病學會RA分類标準。患者正規應用非甾體類抗炎藥、強的松(Pred)、甲氨蝶呤(MTX)、環孢菌素A(CsA)、氯喹等治療，且曾經多種免疫抑制劑聯合應用，病情均未能得以控制，未達到ACR20标準，病程中逐漸出現了雙手關節的骨質破壞及雙腕關節融合。因反複治療效果不佳，且患者有生育要求，多種藥物應用受限，故考慮行大劑量化療及外周血幹細胞移植。自2001年3月15日幹細胞動員到5月18日大劑量化療(預處理)後幹細胞回輸，整個過程順利，無并發症發生。現随訪已滿10個月，患者關節腫痛消失，ESR、CRP降至正常，RF轉陰，已達ACR70标準，且已停用所有免疫抑制劑。目前能從事正常工作，生活質量明顯提高。

　　二、基因治療：
　　
　　基因治療是指爲了治療目的，将新的遺傳物質導入機體細胞的療法。理論上講，任何能抑制RA病理的分子都是基因治療潛在的目标。由于自身反應性T細胞在RA的病理生理中起主導作用，而細胞因子又是介導這些免疫反應的介質，所以，目前RA基因治療的靶基因主要針對這些細胞因子，包括抗炎症、免疫反應的白細胞介素-1受體拮抗劑(IL-1 receptor antagonist，IL-lRa)和可溶性腫瘤壞死因子受體(soluble TNF receptor，sTNFR) ；調節免疫反應的IL-4、IL-10、IFN-β；誘導細胞凋亡或抗滑膜增生的FasL以及黏附因子等等。
　　
　　目前，RA的基因治療在關節炎動物模型中進展較快，大部分RA動物實驗采用了局部基因治療。已研究的載體包括：①小鼠白血病病毒(murine leukemia virus，MuLV)：MuLV逆轉錄病毒是在所有RA動物基因治療中最常用的載體，應用兔膝關節作爲模型，MuLV載體可使導入的IL-lRa基因表達6周。②慢病毒和腺病毒相關病毒(adeno-associated virus，AAV)：二者可整合到人染色體上，能夠将治療基因導入關節滑膜表達。③腺病毒和單純疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)：可以獲得高水平的基因表達。但是，第一代的腺病毒載體會引起炎症，而HSV載體則有細胞毒性。在臨床試驗方面，世界上第一例RA基因治療的臨床實驗是1996年7月經美國FDA批準在匹茲堡醫學中心進行的，目前已成功完成了9例RA患者局部基因治療的I期臨床試驗，初步結果顯示将治療基因在RA關節導入、表達，是安全的和可行的。 
　　
　　我院已于2001年開展了RA基因治療的動物實驗，拟通過動物實驗，建立并完善治療RA的基因轉移方法，爲将來進入臨床試驗奠定基礎。技術路線包括：(1)建立RA動物模型：将MFG-hIL-1β基因轉移至兔膝滑膜，使其組成性表達hIL-1β，産生與人RA極其相似的病理改變。此模型以IL-1β爲炎症抗原，與RA的發病機制密切相關。(2)采用先進的離體基因治療方法，進行兔膝關節炎基因治療的研究。(3)将逆轉錄病毒攜帶的治療基因導入RA關節，使其選擇性地到達靶組織并持續表達，爲将來的臨床試驗奠定基礎。截止到目前，我院已建立MFG-hIL-1β-neo重組體轉染HIG-82細胞系導緻嚴重滑膜炎的兔RA動物模型，正在進行人IL-1Ra基因腺病毒重組體直接體内基因轉移治療RA的動物實驗；已成功培養正常兔自體原代滑膜成纖維細胞，細胞生長狀态良好，可用于離體基因治療時體外病毒轉染。 
　　
　　RA作爲一種至今發病機理不明、治療效果不佳、緻殘率很高的自身免疫性疾病，至今無滿意的治療藥物：傳統的慢作用抗風濕藥副作用大，患者耐受差；新型的生物制劑費用昂貴、不能口服、體内清除快、靶向性差。而造血幹細胞移植和基因治療從理論上可能克服以上缺陷，是兩種新的非常有前途的治療手段。而從幹細胞水平和基因水平研究RA患者的免疫功能，将對RA發病機理的探索開辟新的途徑，有很好的研究前景。