細胞凋亡實驗步驟及簡介

一、試驗最終目标

1、掌屋衰老蛋白質的型态型态 2、學會用紅部份探針對蛋白質透過雙标明來檢測較長時間能活蛋白質、衰老蛋白質和腫脹蛋白質的工具

二、試驗原理

蛋白質死亡根據其性質、是從及脊椎動物學意味辨别爲衰老和腫脹兩種不同一般來說。衰老普遍發揮作用于永生界，在脊椎動物個錐體和适應環境中所起着非常關鍵性的不作用。它是蛋白質在一定生理前提下一系列順序排列牽涉到事件的組合，是蛋白質遵循一定表征自己結束永生的獨立自主控制反複。蛋白質衰老具有可辨認的靈長類和脊椎動物化學型态。

在型态上可見衰老蛋白質與周圍蛋白質脫離碰觸，蛋白質變園，蛋白質膜向内皺縮、胞漿濃縮、細胞質蠶食、蛋白質加成器固縮過熱呈圓形團塊形如或新月形如分布區、細胞質和蛋白質膜進一步融爲一體将蛋白質分爲多個完拆成中空的衰老小錐體，衰老小錐體最後被吞噬蛋白質吞噬新陳代謝。在衰老反複中所蛋白質以下内容物非常釋放到蛋白質部份，可能會影響其它蛋白質，因而不激起炎症加成。

在脊椎動物化學上，多數蛋白質衰老的反複中所，誘導加成器酸内切蛋白質能激活，能活性增加。加成器DNA随機地在加成器小錐體的連接部位被蛋白質切斷，水解爲180-200bp或它的拆成倍數的各種片斷。如果對加成器DNA透過瓊脂糖PET，可辨識以180-200bp爲基數的DNA ladder（梯形如帶紋）的型态。

相比之下，腫脹是蛋白質正處于無可避免細菌感染前提下牽涉到的蛋白質死亡。蛋白質在腫脹現代即歸因于質膜相容性，各種蛋白質器增大，進而質膜崩解釋放出其中所的以下内容物，激起炎症加成，腫脹反複中所蛋白質加成器DNA雖也水解，但由于發揮作用各種長度不等的DNA片斷，隻能形成梯形如帶紋，而呈圓形彌散形如。

一些平易近人的細菌感染刺激及一些抗藥劑可抑止蛋白質衰老，并不一定這些因素在抑止衰老的同時，也可抑止蛋白質腫脹，這取決于細菌感染的無可避免程度和蛋白質本身對刺激的脆弱程度。

冬青酰酰（HT）是我國而無須研制的一種對急性粒蛋白質肺炎，急性單加成器肺炎等有良好的抗藥劑。深入研究表明HT在0.02~5μg/ml範圍内不作用2小時，即可抑止HL-60蛋白質衰老，并表現出迥然不同的衰老型态。本試驗用1μg/ml HT在錐體部份抑止培植的HL-60蛋白質牽涉到衰老，同時也有少數蛋白質牽涉到腫脹。用Hoechst33342和碘化丙啶（propidium iodide，PI）對蛋白質透過雙重皮膚上，可以不同之處衰老、腫脹及較長時間蛋白質。

蛋白質膜是一選擇性的蛋白質培植，一般的脊椎動物染色劑如PI等隻能越過質膜。當蛋白質腫脹時，質膜不完拆成，PI就轉入蛋白質部份部，它可緩沖到DNA或RNA中所，使腫脹蛋白質制做，衰老蛋白質和能活蛋白質不制做。而一些能活蛋白質染色劑由于爲親脂性水銀體，可跨膜轉入能活蛋白質，因而可透過能活蛋白質皮膚上。Hoechst33342是一種能活性紅部份染色劑且口服較弱，它是雙苯并咪唑的一種衍脊椎動物。與DNA特異結合（主要結合于A-T）酰基區），辨識衰老蛋白質和能活蛋白質。凡是看到有衰老小錐體的蛋白質都是衰老蛋白質。

三、試驗用品

1、醛：冬青酰酰（HT），300μg/ml，100mmol/L Tris-HCl（pH7.5），5mol/L EDTA蛋白蛋白質、酰性裂解水銀：0.2mol/L NaOH, 1%SDS、醋酸鈉：3mol/L KAc（pH4.8）；異丙醇；70%混合物；溴酚藍，蔗糖指示劑。TBEPET蛋白蛋白質，1%瓊脂糖，溴乙錠。PI母水銀：500μg/ml；Ho33342母水銀：2mmol/L。 2、儀器設備：紅部份孔徑，PET儀，PET槽，微量加樣器（1ml，100μl）0.5、1.5ml離心管，載玻片，蓋玻片。

四、試驗金屬材料

人早幼粒肺炎HL-60蛋白質，用包涵10%公牛隊血清的RPMI1640菌種在37℃，5%CO2前提下培植。

五、工具步驟

1、冬青酰酰抑止HL-60蛋白質衰老 （1）試驗前約24小時，傳染兩玻璃瓶HL-60蛋白質，标明①、②，每玻璃瓶包涵約6ml培植水銀，置37℃，5%CO2培植箱培植。 （2）試驗前約2.5小時，當蛋白質通量達到70%，①号玻璃瓶重新加入冬青酰酰200μl，使終濃度爲1μg/ml，②号玻璃瓶中所重新加入同等量PBS（pH7.4）不作比對。共同放入培植箱中所繼續培植2.5小時。

2、Ho33342和PI雙重皮膚上辨認三種蛋白質 （1）皮膚上：将玻璃瓶中所的蛋白質搖勻取200μl于1.5ml的離心管中所，重新加入Ho33342母水銀2μl，PI 20μl，皮膚上15分鍾。 （2）滴片：取一載玻片用雙面膠圍成一小室，從離心管中所各取以上皮膚上後的蛋白質懸水銀10μl，重新加入小露天蓋上蓋玻片，紅部份鏡下用紫部份展示出亮，高倍鏡下通過觀察，不同之處三種蛋白質，并注意三者%。

六、要點

1、抑止培植HL-60蛋白質時間要直觀； 2、紅部份孔徑下通過觀察蛋白質時，由于紅部份易碎叛，通過觀察時要盡量快。