胰腺癌基因診斷研究進展

    探讨對胰腺癌診斷有意義的基因指标。方法　複習國外有關胰腺癌基因診斷方面的文獻。結果　K-ras、p53、DPC4和端粒酶基因可用于胰腺癌臨床診斷。結論　胰腺癌相關基因的檢測可用于胰腺癌的早期診斷。
　　
ADVANCES IN GENETIC DIAGNOSIS OF PANCREATIC CANCER

JIANG Jin-bo, XU.. Feng, SHOU Nan-hai.

　　(Department of General Surgery, The First Affiliated Hospital, Shandong University of Medical Sciences, Jinan 250012)

　　【Abstract】　Objective　To search for the significant gene indicators in the diagnosis of pancreatic cancer. Methods　Literatures about genetic diagnosis of pancreatic cancer were collected and reviewed. Results　K-ras, p53, DPC4 and telomerase genes were considered to play important roles in the diagnosis of pancreatic cancer. Conclusion　Detection of the genes related to pancreatic cancer may be of helpful in early diagnosis of pancreatic cancer.

　　【Key words】　　Pancreatic cancer　　Genetic diagnosis

　　胰腺癌發病率逐年升高，美國1997年死于胰腺癌的患者超過28 000人，列癌症死亡的第5位。胰腺癌确診後平均生存時間不超過6個月，平均5年生存率低于5%。胰腺癌早期診斷困難，85%的患者出現症狀時已發生淋巴結或遠處轉移，失去了手術時機〔1〕。近年來胰腺癌基因學研究取得了較大的發展，爲胰腺癌的早期診斷和治療開辟了新的途徑。目前各國學者研究最多的胰腺癌相關基因是ras基因、p53基因、端粒酶基因和近年來發現的DPC4基因，現就此做一簡要綜述。

　　1　K-ras基因

　　K-ras基因是一種原癌基因，位于染色體12p12.1上，編碼的p21蛋白具有重要的信息轉導作用。突變後的ras基因所編碼的蛋白會喪失滅活的功能，從而刺激細胞自發性生長和分化，導緻腫瘤發生。K-ras突變見于80%～95%的胰腺癌中。大多數報道認爲，K-ras突變與胰腺癌預後、分期無關。

　　1.1　胰液的應用

　　最初認爲K-ras突變是與胰腺癌有關的特異性變化，可以作爲判斷胰腺癌存在的敏感标記物。最近研究發現，胰腺良性腫瘤〔2〕、慢性胰腺炎或胰腺囊腫中也存在較高的K-ras突變率，因此，不能僅依據K-ras突變來診斷胰腺癌。Tateishi等〔3〕于注射胰泌素後在内窺鏡膽道造影(ERCP)下收集胰液檢測，結果K-ras突變率在單純性胰腺囊腫爲43%(6/14)，胰腺癌中爲50%(10/20)，導管内狀瘤爲60%(9/15)，在慢性胰腺炎爲17%(1/6)。由于這種方法特異性較強，對于胰腺癌的篩選診斷有一定的實用性。

　　1.2　糞便的應用

　　Caldas等〔4〕用斑點雜交技術檢測出胰腺癌患者糞便中K-ras突變率爲55%(6/11)。與直接收集胰液相比，糞便中檢出率較低。并且25%大腸癌和30%大腸腺瘤糞便中也可檢出K-ras變異，所以這種方法的特異性不高。但由于簡單易行，可用于胰腺癌的普查。

　　1.3　外周血漿的應用

　　此方法與上述方法相比，具有簡單、無損傷、準确性高和可反複檢測等優點。Hugh等〔5〕采用RFLP-PCR法檢測到胰腺癌患者外周血漿K-ras突變率爲81%(17/21)，5例健康人和3例慢性胰腺炎者均爲陰性。4例疑診患者在确診爲胰腺癌之前，其血漿均檢出K-ras突變，而活檢标本組織學檢測和組織DNA檢查均爲陰性，直到确診時才出現陽性。由此可見，血漿K-ras突變檢測的敏感性高于常規腫瘤診斷方法，将來可望成爲診斷胰腺癌的快速準确的方法。另一項研究發現，胰腺癌患者血漿K-ras突變率爲57%(12/21)〔6〕，且K-ras基因突變陽性者的腫瘤比陰性者大，切除可能性小。手術及放化療後血漿K-ras基因突變監測發現，持續陽性者複發早，提示這類患者預後差。可見這種方法還可用于評估腫瘤的大小、切除的可能性以及預後。另外，雖不能說血中微量癌細胞經血行後全部形成轉移竈，但這種檢查在輔助療法選擇上有一定的參考價值。

　　1.4　分子病理分期方面的應用

　　胰腺癌區域淋巴結的轉移情況主要由常規病理決定。常規病理切片存在取樣誤差，且微轉移或浸潤竈不易識别。Demeure等〔7〕用PCR-RFLP法檢測了22例胰腺癌的區域淋巴結，常規病理分期均爲Ⅰ期(T1～2N0M0)。結果有至少一個淋巴結檢測到K-ras突變的病例占73%(16例)。因此，可以通過檢測K-ras突變來證實常規病理難以發現的淋巴結微轉移，而淋巴結微轉移是胰腺癌預後差的一個原因，并且輔助性放化療可提高這類患者的生存率〔8〕。另外，這種分子病理學方法也可用于檢測腹腔沖洗液、肝髒活檢組織、腫瘤切緣的情況以及鑒别來源不明的轉移癌。Inoue等〔9〕檢測了17例胰腺癌患者的腹腔沖洗液以及随機肝穿刺标本，結果13例發現隐匿性肝轉移，2例腹腔沖洗液陽性，而常規病理與細胞學檢查均爲陰性。可見分子病理學有助于胰腺癌準确分期，對選擇治療方案和判斷預後有指導意義。

　　2　p53基因

　　p53基因位于染色體17p上，編碼分子量53 kd的p53蛋白，突變的p53喪失了調節細胞周期的重要作用，導緻腫瘤發生。在人類癌症患者中有半數可檢出p53改變，大多數報告顯示胰腺癌中p53突變率約40%～70%。因p53突變存在于多種腫瘤中，且在胰腺癌中突變率遠低于K-ras基因，在某些良性胰腺疾病中也可出現陽性，故p53突變在胰腺癌診斷中應用有待于深入研究。

　　2.1　臨床檢測

　　變異的p53基因所編碼的p53蛋白半衰期延長，用免疫組化法易于檢出。據報道，37%～64%的胰腺癌組織中可檢出p53蛋白過度表達，與p53突變率基本一緻。所以，癌蛋白也可做爲一種新的腫瘤标記物。Suwa等〔10〕對血清中p53蛋白濃度進行檢測，發現胰腺癌血清中p53蛋白濃度顯著超過健康人和慢性胰腺炎患者。胰腺癌遠處轉移患者的血清p53濃度顯著高于無轉移組。胰腺癌切除後的p53蛋白濃度比術前明顯下降，說明血清中變異p53蛋白來自于腫瘤，且随着腫瘤的進展而升高，因此可用于胰腺癌的診斷，并可用于判斷腫瘤的進展情況。另外，檢測胰液p53蛋白和血清p53蛋白抗體也有助于胰腺癌診斷。

　　2.2　與預後的關系

　　關于p53蛋白過度表達與胰腺癌的預後方面報道結論不一緻，多數學者認爲p53蛋白陽性者預後差，生存期短。Lundin等〔11〕對133例胰腺癌研究後發現，p53蛋白過度表達與生存時間無關。Makinen等〔12〕發現，41%(24/59)胰腺癌過度表達p53蛋白，但與腫瘤分級以及所有的臨床指标或結果無關。各家報道矛盾的原因尚待進一步研究。

　　3　端粒酶

　　研究發現癌細胞及生殖細胞中存在着延長端粒的端粒酶，能以自身RNA爲模闆合成端粒重複序列，即(5′-TTAGGG-3′)n。含有這種酶的細胞可逃避進行性端粒縮短而獲得無限制的生長能力。人正常體細胞端粒酶活性均爲陰性，而90%左右的惡性腫瘤細胞端粒酶呈活化狀态，因此它與以往報道的基因标記物相比有較高的特異性。然而研究也證實末梢淋巴細胞、腸管上皮細胞、造血幹細胞等具有自我增殖能力細胞中也存在陽性端粒酶表達。因此單獨以端粒酶活性的存在并不能簡單斷定癌細胞的存在。内部端粒酶标準定量對比研究發現，癌細胞的活性是正常細胞的10～100倍〔13〕，因而定量化比較端粒酶活性對癌細胞診斷更有重要的參考價值。Hiyama等〔14〕報道95%(41/43)的胰腺癌組織中端粒酶活性呈陽性，而11例良性胰腺腫瘤均呈陰性。36例癌旁組織中，僅5例呈弱陽性，其中2例病理證實有癌細胞微浸潤。此結果提示，端粒酶在正常胰腺和良性胰腺疾病時處于抑制狀态，而在胰腺癌中重新激活，表明端粒酶活化在胰腺癌發生中起重要作用，可以作爲診斷胰腺癌的基因标記物。另有作者〔15〕報道，檢查胰液中脫落細胞的端粒酶活性是診斷胰腺癌的較好而且較早的方法。

　　4　DPC4基因

　　DPC4基因是近年來發現的一種新的抑癌基因，位于染色體18q21.1上，編碼的Smad4/DPC4蛋白是TGF-β傳遞信号到細胞内途徑的一個成員，而轉化生長因子β(TGF-β)可抑制細胞的生長，所以DPC4缺失可促進細胞過度生長〔16〕。最近研究發現〔17〕，p21 WAF1可能參與這個過程的發生。約50%的胰腺癌有DPC4的丢失或失活，其中約30%爲純合性丢失，約20%爲點突變〔18〕，DPC4在其他腫瘤中的失活率通常小于10%，可見DPC4基因丢失或失活在胰腺癌發生中具有特異性，可作爲一種新的胰腺癌标記物。

　　5　其他基因與腫瘤标記物

　　p16抑癌基因位于染色體9p上，編碼的p16蛋白是一種CDK4的抑制物。在約80%的胰腺癌中失活。其他與胰腺癌發生有關的基因還有APC、DDC、Rb-1、C-erbB-2、nm23、DNA錯配修複基因等，這些基因在胰腺癌中表達率較低，故不能單獨作爲胰腺癌基因用于診斷。另外，血清腫瘤标記物(如CA19-9，CAM17.1，胰島澱粉樣肽等)檢查也是胰腺癌診斷的常規方法之一，雖然其敏感性和特異性不高，但由于這一方法快速簡便，其研究仍在不斷深入。

　　6　聯合檢測與胰腺癌變分子機理的研究

　　惡性腫瘤發生都是多階段多步驟的，需要多個基因改變的連續性累積，一般需要3～7個基因突變。有關胰腺癌惡性轉化過程尚未完整闡述，但這方面研究進展非常迅速。Rozenblum等〔19〕報道，77%(30/39)的胰腺癌中可以檢出3種或4種基因突變，說明胰腺癌中同時存在多種基因改變，這對于胰腺癌的鑒别診斷可能有一定的價值。也揭示了胰腺癌惡性程度高的部分分子基礎。Apple等〔20〕對胰腺癌和非胰腺癌标本的正常上皮，導管上皮增生，不典型增生和浸潤癌分别進行免疫組化染色，觀察K-ras、p53以及HER-2/neu(C-erbB-2)基因産物的表達情況，結果發現胰腺癌變過程中進行性累積了基因突變，證實了多步癌變假說。還可以看出癌變過程中各種分子事件發生的順序： K-ras突變和HER-2/neu突變發生較早，是相對早期事件，而p53突變發生在不典型增生向癌轉化附近，爲相對晚期事件。雖然導管增生與不典型增生在非胰腺癌中比較少見，但基因改變與胰腺癌完全相同，說明導管上皮增生及不典型增生即是胰腺癌的癌前病變，這些個體将來發生癌變的可能性較大。也說明在基因改變與病理關系上，胰腺癌與非胰腺癌是沒有區别的。因此，聯合檢測在篩選高危人群，明确癌變進程，早期診斷等方面有應用價值。更重要的是應用基因工程的方法來校正這些變異基因，可達到治愈腫瘤的目的。

　　綜上所述，在胰腺癌診斷上，目前還沒有有效的篩選方法，也缺乏單一可靠的診斷方法。近年來，有關胰腺癌基因學方面的研究進展很快，利用分子生物學技術檢測這些基因改變，有希望成爲一種新的診斷方法。此外，通過對胰腺癌變分子機理的研究，可望爲今後胰腺癌的早期探測、預防以及治療提供理論依據。