乙肝病毒核心區基因變異與細胞免疫

李嘉  朱理珉  梁樹人  李順天  徐健
【摘要】  目的  探讨慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒（HBV）核心區Leu60Val變異與機體細胞免疫水平的關系。 方法  通過流式細胞分析技術（FCM）檢測外周血T淋巴細胞亞群，利用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清細胞因子［幹擾素γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細胞介素2（IL-2）]水平，采用聚合酶鏈反應（PCR）擴增HBV DNA C基因區片段，并對PCR産物直接測序。 結果  91例慢性乙型肝炎患者發生Leu60Val變異者19例，變異率爲20.9%，随病情加重變異率逐漸增加，以重型肝炎組最高；Val60變異株組IFN-γ、TNF-α水平明顯增高（t值分别爲2.584、4.766，P<0.01），CD4+ /CD8+比值逐漸升高（t＝2.275，P<0.05）。 結論  Val60變異株可能通過增加與Ⅰ類人白細胞抗原（HLA-I）的親和力，或上調HLA-I類分子的表達，從而激活大量的細胞毒性T淋巴細胞釋放細胞因子，并同時在肝髒局部發揮免疫效應，提高對宿主的殺傷力。

【關鍵詞】  肝炎病毒，乙型； 變異； 細胞因子； T淋巴細胞亞群； 序列

Relationship between the HBV core gene mutation and the cellular immunity in host  LI Jia, ZHU Li-min, LIANG Shu-ren, LI Shun-tian, XU Jian. Tianjin Infectious Diseases Hospital, Tianjin 300192, China
【Abstract】    Objective    To study the relationship between the mutation of Leu60Val in HBV core region and the cellular immunity in patients with chronic hepatitis B (CHB). Methods    HBV DNA C gene mutation was confirmed by polymerase chain reaction (PCR) and sequencing the products directly. The cytokines (IFN-γ, TNF-α and IL-2) levels in serum were measured by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The distribution of T-lymphocyte subpopulations in peripheral blood was detected by flow cytometry (FCM). Results    The mutation of Leu60Val was found in 19 out of the 91 CHB patients. With the CHB severity, the mutation rate was getting higher, especially in the severe hepatitis group. The IFN-γ and TNF-α levels were much higher in mutant strain group than those in wild strain group (t = 2.584, 4.766, P < 0.01), so was the ratio of CD4+/CD8+ (t = 2.275, P < 0.05). Conclusion    The mutant strain of 60Val may increase affinity to HLA-I molecule, or up-regulate the expression of HLA-I molecule, resulting in the activation of CTL to release the cytokines and cause immune response in liver.
【Key words】    Hepatitis B virus;  Mutation;  Cytokines;  T-lymphocyte subpopulations;  Sequence

　　慢性乙型肝炎患者的肝細胞損傷主要是由于機體針對乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）發生的免疫反應所引起，其中作爲效應細胞的CD8+細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）是肝細胞發生病理損害的主要介導者，而針對HBV核心抗原（hepatitis B core antigen，HBcAg）的CTL應答是決定病毒是否被清除的關鍵。當HBV基因發生變異，可以改變氨基酸分子的表達，尤其當CTL識别的重要表位發生變異會改變機體針對病毒的免疫反應。本實驗通過對HBV DNA C基因區進行核苷酸序列分析，并同時檢測患者外周血T細胞亞群（CD4+、CD8+）及血清細胞因子水平［γ幹擾素（interferon γ，INF-γ）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）及白細胞介素2（interleukin 2，IL-2）］，從而了解HBV核心區第60位亮氨酸變異爲缬氨酸（Leu60Val）的情況及機體的免疫狀況，探讨在慢性乙型肝炎中，HBV核心區Val60變異株與機體細胞免疫水平的關系。

資料與方法

1．病例選擇：病例爲天津傳染病醫院1999年10月～2001年10月收治的91例慢性乙型肝炎患者，其中輕度21例，年齡（34.95±11.38）歲；中度24例，（36.05±13.45）歲；重度23例，（35.45±10.47）歲；重型肝炎23例，（39.71±12.20）歲。血清甲、丙、丁、戊、庚型肝炎病毒血清學标志檢測均陰性。診斷符合符合2000年西安修訂的病毒性肝炎診斷标準[1]。

2．HBV DNA C基因區擴增及序列分析：根據GeneBank公布的31條HBV全基因序列，選取C基因區兩端保守區域，設計合成2條特異性引物（C1和C2）進行PCR擴增，并經Pcrdesn軟件進行檢驗，測序引物爲C3。引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物C1 5′-TGGAGACCACCGTGAACGCC-3′（nt 1609～1628），C2 5′-AAAGACAGGTACAG TAGAAG-3′（nt 2516～2497），C3 5′-GGCGAG GGAGTTCTTCTTCTAGGGG-3′（nt 2364～2388）。dNTP爲美國Gibco公司産品，Taq DNA聚合酶、Tris飽和酚購于北京鼎國生物技術發展中心，DNA測序試劑盒爲加拿大Visible Genetic公司的末端标記試劑盒及OpenGene 自動DNA測序儀和Version 3.0進行DNA測序電泳及序列分析。提取血清DNA，采用PCR擴增HBV DNA C區基因，電泳後在紫外光下檢測PCR産物，采用瓊脂糖凝膠電泳回收法回收産物，并進行産物的純化，采用雙脫氧鏈末端終止法進行測序反應，對測序産物純化後進行測序電泳。

3．血清細胞因子檢測：IFN-γ、TNF-α和IL-2試劑盒購自美國Gibco公司。采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法檢測，一抗爲生物化學抗體，二抗爲辣根過氧化物酶标記的streptavidin，用标準品繪制曲線并計算429nm吸光度時标本濃度。

4．外周血T細胞亞群的檢測：采用流式細胞術，選用三色熒光标記的免洗試劑（TriTESTTM CD4 FITC+CD8PE+CD3PerCP）直接熒光染色。熒光标記試劑、紅細胞裂解液及同型對照均爲美國BD公司的産品。取抗凝血1ml，先将白細胞數調至（4.0～10）×109/L，在管底部加入CD3/CD4/CD8三色直标熒光抗體20μl和混勻的肝素抗凝血100μl，徹底混勻後室溫避光30min。加１×紅細胞裂解液1ml于試管内充分混勻，室溫避光保存15min，上機檢測。

5. 統計學處理：各組間率的比較用χ2檢驗，各組間均數比較用t檢驗，方差分析用F檢驗。

結    果

1. HBV核心區第60位氨基酸（aa60）變異情況：參照我國HBV流行株（C基因型）标準序列[2]，進行核酸序列對齊比較。91例慢性乙型肝炎患者中19例（20.9%）發生aa60變異，爲亮氨酸Leu被缬氨酸Val替代（即第2078位核苷酸C被G替代）。其中慢性輕度3例（14.3%)，中度4例(16.7%)，重度5例(21.7%)，重型7例(30.4%)。提示随病情加重aa60變異率增加，以重型肝炎組最高。

2．将慢性肝炎患者分爲aa60變異株組和aa60野生株組，分别比較二組之間細胞因子水平、T細胞亞群分布的變化情況，aa60變異株組IFN-γ、TNF-α及IL-2水平均高于野生株組，其中變異株組的IFN-γ及TNF-α水平分别與野生株組比較，差異有顯著性；同時變異株組CD4+相對數及CD4+/CD8+比值高于野生株組，CD8+相對數明顯低于野生株組，其中CD4+/CD8+比值差異有顯著性（表1、2）。

表1  aa60變異株組和野生株組血清細胞因子
水平的比較（x-±s，pg/ml）
組别 例數   IFN-γ  TNF-α IL-2
變異株組 19 53.3±14.8** 50.1±10.3* 31.6±13.3
野生株組 72 41.1±19.0 35.6±16.1 29.5±15.2
  IFN-γ：γ幹擾素；TNF-α：腫瘤壞死因子α； IL-2：白細胞介素-2；與野生株組比較，* t′TNF-α=4.766，P<0.05；** tIFN-γ=2.584，P<0.01，tIL-2=0.553, P<0.01
表2  aa60變異株組和野生株組外周血T細胞亞群
分布的比較（x-±s，%)
組别 例數     CD4+     CD8+ CD4+/CD8+
變異株組 19 47.1±11.1 29.8±10.0 1.8±0.5
野生株組 72 45.9±14.2 35.0±16.2 1.4±0.7
  tCD4+=0.341，t′CD8+=1.731，tCD4+/CD8+=2.275，P<0.05

讨     論

　　HBV本身并不直接損傷肝細胞，病毒所激發的免疫應答和免疫病理反應才是乙型肝炎發病的關鍵，其中CTL是細胞免疫反應的主要執行者，是徹底清除HBV的決定因素[3，4]。

　　CTL可以通過分泌包括TNF-α和IFN-γ在内的多種具有抗病毒作用的細胞因子[5，6]發揮免疫效應。其中IFN-γ具有活化CD4+、CD8+及 NK細胞殺傷肝細胞的作用，是抗病毒防禦效應的重要機制；而TNF-α則與肝細胞的壞死密切相關。因此CTL被活化後在發揮抗病毒效應時還能引起肝細胞的損傷甚至嚴重的肝衰竭。

　　目前國内關于HBV核心區基因變異的研究多集中在前C區A1896變異，有關C基因區變異及這些變異與機體細胞免疫水平關系的研究則鮮見報道。HBV核心區包含有多個T細胞識别的表位，其中aa48～60是重要表位之一，而aa60正位于其中（編碼核苷酸爲nt 2078～2080）。本實驗通過對HBV DNA C基因區進行核苷酸序列分析，并同時檢測患者外周血T細胞亞群及血清細胞因子水平，從而了解HBV核心區第60位氨基酸的變異情況及機體的細胞免疫狀況，探讨在慢性乙型肝炎中HBV核心區aa60變異與機體細胞免疫水平的關系。實驗數據顯示Val60變異株在各慢性肝炎組均存在，且随着病情加重變異率有升高趨勢，以重型肝炎組最高（但由于樣本數少統計學分析差異無顯著性）。同時變異株組IFN-γ、TNF-α水平明顯增高，CD4+/CD8+比值逐漸升高，提示Val60變異株與病情加重和免疫功能異常密切相關。

　　Leu60Val變異與肝髒疾病的進展有關[7]。在機體的免疫應答中，T細胞對的識别主要集中在一個殘基，它是T細胞反應的關鍵，僅僅單個氨基酸的改變，便可以影響抗原與HLA-I類分子的結合力，或改變TCR的識别效率；大多數突變分子的結合能力有一定下降，但少數突變分子的結合能力卻可以顯著增加[8]。本實驗結果顯示單個氨基酸殘基的改變與疾病程度和免疫功能異常有明顯相關性，提示可能是Val60變異株能夠增加與HLA-I類分子的親和力，或增強HLA-I類分子的表達，從而提高了CTL對宿主的殺傷力，臨床表現爲血清細胞因子水平及外周血T細胞亞群分布的變化。實驗中還發現Val60變異株組還伴有CD8+細胞相對數明顯下降及CD4+/CD8+比值升高。Webster等[9]實驗發現在丙氨酸氨基轉移酶（alanine amino-transferase，ALT）升高與不升高的慢性乙型肝炎患者的肝組織中HBV特異性CTL的數量沒有差異，但ALT升高組的肝組織中T細胞的總數大大增加；而Maini等[10]提出慢性乙型肝炎患者的肝損害可能是由肝外聚集而來的特異性和非特異性的CD8+細胞。本實驗結果顯示Val60變異株可能增加了與HLA-I類分子的親和力，或增強HLA-I類分子的表達，從而大大增強了CTL的活化增殖，在分泌較多數量IFN-γ、TNF-α的同時，衆多CTL細胞聚集到肝髒中發揮免疫效應，損傷大量HBV感染的肝細胞。

　　變異的HBV病毒可能通過各種途徑改變機體的免疫應答，引起HBV的持續感染或肝細胞損傷，甚至肝衰竭。因此同時監測HBV變異情況及機體免疫狀況，有助于了解二者的相關性，爲進一步闡明二者的因果關系提供依據。

參  考  文  獻
1中華醫學會傳染病與寄生蟲病學分會、肝病學分會. 病毒性肝炎防治方案. 中華肝髒病雜志, 2000, 8: 324-329.
2郭亞兵, 侯金林, 戴炜，等.乙型肝炎病毒中國株全基因參照序列初步建立. 中華微生物學和免疫學雜志, 1999, 19: 197-200.
3Ferrari C, Penna A, Bertoletti A, et al. Cellular immune response to hepatitis B virus-encoded antigens in acute and chronic hepatitis B virus infection. J Immunol, 1990, 145: 3442-3449.
4Milich DR, McLachlan A, Moriarty A, et al. Immune response to hepatitis B virus core antigen (HBcAg): localization of T cell recognition sites within HBcAg/HBeAg. J Immunol, 1987, 139: 1223-1231.
5Prezzi C, Casciaro MA, Francavilla V, et al. Virus-specific CD8(+) T cells with type 1 or type 2 cytokine profile are related to different disease activity in chronic hepatitis C virus infection. Eur J Immunol, 2001, 31: 894-906.
6Tomaras GD, Greenberg ML. CD8+ T cell mediated noncytolytic inhibition of human immunodeficiency virus type I. Front Biosci, 2001, 6: 575-598.
7駱抗先，主編. 乙型肝炎基礎和臨床. 北京: 人民衛生出版社, 2001. 65.
8餘傳霖, 葉天星, 陸德源, 主編. 現代醫學免疫學. 上海: 上海醫科大學出版社, 1998. 217.
9Webster GJ, Reignat S, Maini MK, et al. Incubation phase of acute hepatitis B in man: dynamic of cellular immune mechanisms. Hepatology, 2000, 32: 1117-1124.
10Maini MK, Boni C, Lee CK, et al. The role of virus-specific CD8(+) cells in liver damage and viral control during persistent hepatitis B virus infection. J Exp Med, 2000, 191: 1269-1280.
（收稿日期：2002-07-29）
（本文編輯：金生）
作者單位：300192 天津市傳染病醫院
李嘉 女，34歲，醫學碩士，主治醫師。