溶栓法對急性心梗者的影響

　　免疫組織化學方法證實在梗死的心肌組織有膜攻擊複合物C5b-9沉積[1]。急性心肌梗死患者血清中激活的補體片段濃度升高[2]。這些研究表明，急性心肌梗死伴随着補體系統的激活。近年來又發現溶栓治療可以進一步激活急性心肌梗死患者的補體系統[3～6]。激活的補體系統至少通過兩條途徑損害心肌細胞[7]：一是複合物C5b-9結合并攻擊心肌細胞膜;二是激活中性粒細胞和損傷血管内皮細胞引起再灌注損傷。但是，目前仍不清楚溶栓後補體系統的活化能否增加循環系統中性粒細胞表面的補體含量而引起中性粒細胞的激活。因此，我們應用免疫熒光技術和流式細胞術，測定急性心肌梗死患者靜脈溶栓後沉積于中性粒細胞表面的補體片段C3c含量的動态變化。

　　方 法

　　一、病例選擇

　　16例無明顯心衰和心源性休克的急性心肌梗死患者(AMI組)，男14例，女2例，年齡(61±5)歲，胸痛至入院的時間爲2～24 h(7 h±5 h)。急性心肌梗死的診斷依據是典型的臨床表現，心電圖出現新的異常Q波或ST段擡高以及心肌酶升高(CK大于正常上限2倍)。無溶栓禁忌證者在胸痛6 h内入院，或超過6 h但仍有明顯胸痛或ST段顯著擡高且相關導聯有明顯A波者給予溶栓治療。6例用鏈激酶(SK 150萬U/60 min)，4例用重組型纖溶酶原激活劑(r-TPA 50 mg/60 min)，6例用尿激酶(UK 100萬～150萬U/60 min)靜脈溶栓。其他治療包括阿司匹林、β阻滞劑、酯類和血管緊張素轉化酶抑制劑等。三組患者均無感染、惡性腫瘤或自身免疫性疾病的證據。18例(男15例，女3例，年齡58歲±6歲)無器質性疾病的健康受試者作爲對照組。急性心肌梗死患者在溶栓前，溶栓後30 min、60 min及120 min采靜脈血2 mL。血标本置入EDTA抗凝管，30 min内用抗人C3c熒光抗體标記。

　　二、免疫熒光标記

　　用免疫熒光抗體标記中性粒細胞表面補體片段C3c的沉積。具體操作步驟如下：每次取抗凝全血30μL和等量NaN3-PBS加入三支玻璃試管，4℃紅細胞裂解液5 mL溶解紅細胞，低速離心，棄上清，NaN3-PBS沖洗細胞兩次。細胞複懸于50μL NaN3-PBS，第一管加入FITC标記的兔抗人C3c單克隆抗體5μL(Dako)，第二管加入FITC/PE雙色标記的鼠抗人CD45+CD14抗體5μL(Becton Dikinson)，第三管加入NaN3-PBS 5μL作空白對照。室溫下暗室中孵育30 min，再用NaN3-PBS沖洗細胞兩次，加1%多聚甲醛0.5 mL固定後置4℃冰箱保存，24 h内用流式細胞儀測定。

　　三、流式細胞術

　　Becton Dikinson FACS Calibur流式細胞儀測定中性粒細胞表面C3c的熒光強度。用空白對照和陰性對照消除自發熒光和非特異熒光的影響。根據細胞大小，細胞内顆粒密度，前散射(forward light scatter, FSC)和側散射(side light scatter, SSC)将白細胞區分爲淋巴細胞、單核細胞和中性粒細胞三個亞群，依CD45、CD14的熒光強度進一步證實三種白細胞亞群的。圈出拟測定的細胞亞群，分析5000～10000個細胞。熒光信号以直方圖或二維dot-plot散點圖儲存于電子計算機，自動分析每個細胞的平均熒光強度(mean fluorescence intensity, MFI)。

　　四、統計學處理

　　計量資料用Mean±SD表示。兩樣本均數比較采用t檢驗。多個樣本均數比較方差齊時采用方差分析。P<0.05認爲有統計學意義。所有數據輸入電子計算機，用SPSS for Windows 7.5軟件包進行分析。