肝門部膽管癌

   摘要　目的：研究肝門部膽管癌中細胞凋亡和血管形成的相互關系。方法：采用原位末端标記技術和抗因子Ⅷ的抗體分别檢測肝門部膽管癌細胞凋亡指數和瘤内微血管的密度，同時用免疫組化法檢測血管内皮細胞生長因子(VEGF)和膽管癌細胞凋亡調控基因bcl-2的表達。結果：肝門部膽管癌組織VEGF陽性表達率55.56%(20/36)，VEGF陽性表達與MVD呈正相關(P＜0.01)。高血管組的bcl-2陽性表達明顯高于低血管組(P＜0.05)，而低血管組的細胞凋亡指數高于高血管組(P＜0.01)。bcl-2表達豐富的區域，VEGF的表達率高。結論：肝門部膽管癌血管形成影響細胞凋亡的敏感性和發生率。

　　目前研究認爲，腫瘤血管是腫瘤生長和轉移的形态學基礎，腫瘤血管生成受到腫瘤細胞釋放的血管生長因子(VEGF)等的調控。無血管生成的腫瘤組織可能數月、數年不增殖，許多血管生成抑制劑通過提高細胞凋亡比率抑制實驗性腫瘤的增殖和轉移〔1〕。近年來發現，細胞增殖與細胞凋亡不平衡病理狀态與腫瘤的發生發展密切相關〔2〕。但是，對于膽囊腫瘤内的MVD和自發性細胞凋亡在膽囊癌發生發展中的作用，以及它們之間關系的研究報道甚少。爲此，本研究通過觀察肝門部膽管癌中的MVD、VEGF及bcl-2和細胞凋亡指數，以探讨血管生成、細胞凋亡及調控基因在肝門部膽管癌發生中的作用及相互關系。

材料與方法

　　1.病例及組織标本：收集同濟醫院、山東省腫瘤醫院1996年9月至1998年12月手術切除的肝門部膽管癌組織标本36例，其中男26例，女10例，年齡38-73歲(中位年齡52.4歲)。Bismuth Ⅰ型14例，Ⅱ型10例，Ⅲ型8例，Ⅳ型4例；≥2cm 26例，＜2cm 10例；組織學檢查：管狀腺癌16例，狀腺癌12例，未分化癌6例，粘液癌2例；分化程度：高分化15例，中分化8例，低分化13例；有淋巴結轉移占61.1%(22/36)。術後立即将部分腫瘤和癌旁組織投入液氮，-80℃保存備用，其餘部分經10%甲醛固定，石蠟包埋後制成4μm連續切片備檢。
　　2.試劑：鼠抗人因子Ⅷ相關抗原(FⅧR Ag)單克隆抗體(Dako)公司，VEGF多克隆抗體(Santa Cruz公司)，LSAB kit (Dako公司)，bcl-2單克隆抗體(Santa Cruz公司)，細胞凋亡檢測試劑盒(北京中山生物公司)。細胞凋亡檢測采用ISEL法，NBT顯色；MVD、VEGF及bcl-2采用SLAB法免疫組化染色，操作按說明書進行，DAB顯色。用肝癌組織作陽性對照，PBS代替一抗作爲陰性對照。
　　3.結果判定：細胞核内呈藍色反應者爲凋亡細胞。每一病例的切片在非壞死區的5個區域計數3?000個細胞，凋亡細胞在所有計數細胞中所占的百分比爲凋亡指數。bcl-2以細胞漿染成棕黃色顆粒爲陽性。按5%以上細胞漿或細胞膜呈棕黃色染色爲VEGF陽性〔3〕。MVD記數參照Maeda〔4〕報道方法，計算5個視野内微血管數，取其平均數作爲該病MVD值。
　　4.統計與分析方法：χ2、精确概率法、t檢驗。

結果

　　1.肝門部膽管癌組織中MVD和VEGF表達：肝門部膽管癌組織中所有毛細血管、小靜脈和小動脈内皮細胞爲FⅧR Ag染色陽性，分布具有異質性，腫瘤邊緣多于腫瘤内部。36例肝門部膽管癌組織MVD平均爲(35.6±9.8)個，VEGF陽性表達率55.56%(20/36)，其表達也具有明顯的異質性，強陽性染色的癌細胞多位于浸潤前緣，内皮細胞也呈弱陽性染色，周圍正常粘膜未見VEGF陽性表達。VEGF陽性表達與MVD呈正相關(P＜0.01)。
　　2.凋亡細胞及bcl-2表達：肝門部膽管癌組織中的細胞凋亡率爲88.33%(30/36)，凋亡指數0.28%-8.60%，平均爲(3.46±0.62)%。高分化腺癌中的凋亡細胞數明顯高于低分化腺癌及轉移癌，并且呈片狀或塊狀分布。bcl-2在肝門部膽管癌中陽性表達率爲44.44%(16/36)。bcl-2染色陽性者凋亡細胞數明顯少于bcl-2陰性者(P＜0.05)。
　　3.MVD與細胞凋亡的關系：肝門部膽管癌中的MVD值中位數爲130個，按此界限分爲高血管組(MVD＞130，16)，低血管組(MVD≤130，20)。高血管組的bcl-2表達明顯高于低血管組(P＜0.05)，高血管組的凋亡細胞指數顯著低于低血管組(P＜0.01)。bcl-2表達豐富的區域，VEGF的表達高，即VEGF表達豐富的區域，凋亡的敏感性降低。

讨論

　　腫瘤血管生成是腫瘤生長的物質基礎，無血管生成的腫瘤可數年不生長，呈休眠狀态，一旦血管開始形成，腫瘤組織則具有快速增殖和轉移的能力〔5〕。細胞凋亡與細胞增殖是反映細胞生長的兩個方面，凋亡與增殖的不平衡狀态是腫瘤形成的基礎〔6〕。有關肝門部膽管癌中血管生成與細胞凋亡相關性的研究目前國内外尚未見報道。
　　腫瘤血管生成受到腫瘤細胞分泌的血管生長因子的調控。VEGF是誘導腫瘤血管生成作用最強的生長因子。研究表明〔7〕，許多腫瘤組織中有VEGF高表達，并且和MVD值的增高呈正相關。本研究顯示，36例膽管癌組織中VEGF陽性表達者MVD平均值明顯高于陰性者，VEGF的表達部位與MVD的分布也具有一緻性。同時發現，抗凋亡基因bcl-2的表達和凋亡指數的檢測結果表明，血管形成豐富的區域，bcl-2基因表達率高，而凋亡指數低，即膽管癌細胞凋亡的敏感性和發生率降低，因此肝門部膽管癌組織中血管形成與自發性細胞凋亡成負相關。本實驗結果與Lu等在胃癌中血管形成與細胞凋亡的研究結論相一緻〔1〕。
　　腫瘤的發生不僅依賴于細胞的增殖，也依賴于細胞凋亡的發生。血管形成是一個引起新血管發生的過程，腫瘤的生長和轉移依賴于血管形成，低氧、細胞因子、激素和蛋白激酶C(PKC)的調控因子能夠通過細胞内的信号途徑調節VEGF的表達。目前研究已證實，腫瘤的血管形成是腫瘤發生和發展的早期事件，而腫瘤細胞的自發性凋亡受到瘤組織中新生血管化程度的顯著影響。本研究表明，腫瘤的血管形成可降低腫瘤細胞的凋亡，推測氧調節在二者中起着重要的調節作用〔8〕。
　　腫瘤的血管形成和腫瘤細胞的凋亡是兩個既相互獨立又有着某種聯系的事件，在腫瘤發生和發展的過程中，腫瘤細胞的凋亡和血管形成具有重要的生物學作用。因此綜合分析二者的相互關系，有助于判斷腫瘤的預後，同時也爲肝門部膽管癌抗血管生成治療提供了理論基礎。相信在膽道癌抗血管生成藥物治療過程中，随着對血管生成和細胞凋亡的動态研究，抗腫瘤血管生成治療将會成爲肝門部膽管癌理想的治療途徑。