大腸癌的自殺基因治療

      腸癌是我國常見的惡性腫瘤之一，常用的手術、化療、放療等傳統的治療方式均未能使其療效得到明顯的提高。随着分子生物學及基因工程的發展，基因治療已成爲研究重點，其中自殺基因治療是一種較爲有效的具有臨床應用潛力的治療策略。它是把某些能将非毒物代謝成細胞毒性 藥物的非哺乳動物酶類合成的基因-自殺基因，經分子生物學途徑導入腫瘤細胞，使之在腫瘤細胞内特異地表達，該基因産物能将無毒的藥物前體代謝爲毒性産物，從而影響腫瘤細胞的DNA合成，引起細胞的死亡。目前用于治療大腸癌的自殺基因主要有HSV-tk基因和CD基因。本文就自殺基因治療大腸癌進行綜述。

　　一、 腫瘤的特異性靶向轉導

　　大腸癌的自殺基因治療包括：構建攜帶自殺基因的重組病毒載體；目的基因的轉導；藥物前體治療腫瘤細胞。爲了能使目的基因安全有效地整合到“靶細胞”中，目前構建病毒載體多包含有細胞專一性的基因表達調控元件，使自殺基因隻能在靶細胞中表達，而對周邊正常的組織細胞無傳染，從而保證了特異性的靶向轉導作用。蔣瓊等［1］構建了以CEA基因啓動控制的HSV-tk和EC-CD表達質粒pCEA-tk和pCEA-CD,然後分别與pSV2-neo共轉染結腸癌細胞株LoVo和宮頸癌細胞株Hela，與野生型LoVo細胞相比，LoVo/CEA-tk和LoVo/CEA-CD對GCV和5-FC的敏感性分别提高2 000倍和700倍，而Hela/CEA-tk(或Hela/CEA-CD)仍對GCV(或5-FC)不敏感，結果顯示了癌胚抗原(CEA)基因啓動子驅動自殺基因表達治療結腸癌的優越性。另外，目前采用in vivo法進行目的基因原位轉導［2］，即在瘤體内直接注射病毒上清液或包裝細胞直接接種入瘤體内。Hirschowitz等［3］在結腸癌動物模型的病竈中直接注射AdCMV/CD重組腺病毒上清液，經GCV處理後，發現病竈明顯縮小，與對照組相比，在第6天和第15天腫瘤體積分别縮小46%和74%,這充分說明了瘤體内基因轉導的有效性，in vivo法使自殺基因療法更利于臨床應用。

　　二、 旁觀者效應
　　1993年，Freeman［4］ 在轉導了HSV-tk基因的結腸癌細胞系HCT-116中觀察到GCV不僅對轉導基因的腫瘤細胞有殺傷作用，對于未轉導tk基因的腫瘤細胞也具有殺傷作用，這種現象稱爲“旁觀者效應”(bystander effect,BE)。

　　(一) 縫隙連接與細胞接觸：Bi等［5］認爲前藥的毒性代謝産物或自殺基因表達的酶通過細胞間縫隙連接傳入鄰近細胞，引起細胞毒作用。他們将tk-和tk+的HT1080細胞混合培養，并加3H标記的GCV，結果發現除了tk+的細胞可摻入3H标記的GCV外，與其相接觸的tk-細胞也可摻入3H标記的GCV，而未接觸的tk-細胞内則沒有。Yang-L等［6］用大腸癌細胞體外進行實驗，發現連接蛋白-43與連接蛋白-26在BE中起重要的作用。對于CD基因引起的BE，則不需細胞接觸而發揮作用［4］，5-FU可不通過細胞接觸而發揮細胞毒作用［7］。可以設想，自殺基因表達的産物通過縫隙連接或易化擴散傳遞到周圍細胞後，降低了轉基因細胞内基因表達的産物濃度，在應用藥物前體後，對轉基因細胞殺傷作用減弱，從而延長了其成活時間，也可延長其向外傳遞基因産物的時間，可進一步增強BE的作用。

　　(二) 免疫反應：Caruso等［8］報道在逆轉錄病毒介導轉染的結腸癌轉移動物模型中，經GCV處理後發現腫瘤床有局部的免疫反應，主要是CD4+和CD8+ T細胞，推測免疫反應在自殺基因治療中起一定的作用。Freeman［9］通過PTPCR技術和免疫組 化技術發現，在具有BE的腫瘤細胞内IL-1，IL-6的mRNA表達産物持續增多，使腫瘤細胞内發生強烈的免疫反應。Gagandeep-s等［10］在動物實驗中用表達HSV-tk逆轉錄病毒包裝細胞和結腸癌細胞接種M26小鼠，并且用GCV腹腔注射，結果發現有免疫力的小鼠的腫瘤明顯消退，而在免疫抑制的無胸腺小鼠中卻未發現BE，更證實了免疫反應在抗腫瘤中的作用。

　　三、 聯合治療
　　自殺基因療法有很多優點，由于應用先轉導後治療的途徑，使整個基因治療變得相對容易控制。它還可以直接殺傷腫瘤細胞，具有可誘導免疫反應，可靶向作用等特點。但是，它也存在不足之處，如：自殺基因誘導機體的免疫反應不夠強大，體内應用對腫瘤細胞的轉導效率比較低等。這些均制約着自殺基因的應用，于是，有的學者把目光投向了自殺基因的聯合治療。

　　(一) 自殺基因與細胞因子基因的聯合應用：細胞因子是一類由免疫細胞和相關細胞産生的調節細胞功能的高活性多功能的蛋白質分子，将細胞因子基因轉導入腫瘤細胞内，可以大大增強腫瘤細胞的免疫原性，有效誘導腫瘤細胞特異性抗腫瘤免疫功能。将自殺基因和細胞因子基因聯合應用，可以取長補短，提高治療效果。一方面，自殺基因的表達可以直接殺傷一部分腫瘤細胞，消除腫瘤負荷。另一方面，細胞因子基因的表達可以激發機體的抗腫瘤免疫功能，這種聯合治療也已經在大腸癌治療方面進行了實驗研究。
　　Chen等［11］對小鼠結腸癌肝轉移的動物模型通過重組腺病毒載體分别轉導ADV/RSV-MIL-2基因和ADV/RSV-tk基因，然後給予GCV治療。實驗表明分别用IL-2基因，tk基因和兩者聯合治療的腫瘤面積分别爲120mm2，25mm2和5mm2，并發現抗腫瘤效果的提高與IL-2介導的T細胞免疫增強有關。
　　在此基礎上，Chen等［12］應用HSV-tk基因，IL-2基因和GM-CSF基因聯合治療結腸癌肝轉移的荷瘤小鼠，結果顯示聯合自殺基因和兩種細胞因子基因治療優于tk基因與IL-2基因的聯合治療。證實了腫瘤細胞内GM-CSF的局部表達及IL-2基因的延長表達可以産生持續的抗腫瘤免疫，從而避免了腫瘤的複發，延長動物的成活時間，并探讨其機制如下：HSV-tk/GCV處理引起腫瘤原位死亡，分解爲殘餘碎片，含有肽類物質。GM-CSF表達可激活APCs細胞。肽類物質經APCs細胞處理加工後，把-MHC-Ⅱ類分子複合物提呈給Th細胞并且使其活化，從而産生多種細胞因子，進而激少在CD8+ T淋巴細胞除具有直接溶細胞作用外，尚能産生一些細胞因子，誘導其他細胞的抗腫瘤效應［13］。

　　(二) 自殺基因與放療的聯合應用：目前有的學者已證實了自殺基因治療腫瘤可增加腫瘤細胞對放療的敏感性［14，15］。Gabel-M等［16］在用自殺基因于放療聯合應用治療接種結腸癌細胞的動物模型中也得到了證實。他将接種Widr細胞的裸鼠分爲4組：第一組用放射治療； 第二組用自殺基因(CD基因)治療； 第三組用自殺基因和放療聯合應用； 第四組用5-FU化療和放療。結果表明，聯合自殺基因(CD基因)和放射治療的小鼠腫瘤消退最快，并且腫瘤細胞對放療的敏感性增加，病竈内發現大量的腫瘤細胞死亡。因此，自殺基因系統不管是單獨使用或者與放療聯合應用都是一個很有前途的治療方案。

　　綜上：動物實驗研究證實了自殺基因療法對大腸癌的治療價值，但是實驗研究要過渡到臨床應用尚有不少問題和困難，相信随着自殺基因療法研究的不斷深入，大腸癌的自殺基因治療将不斷完善，并早日爲臨床廣大患者造福。