肝纖維化細胞外基質的組成

　　細胞外基質（extracellular　matrix；ECM）一般包括膠原、非膠原糖蛋白、蛋白多糖及彈性硬蛋白。ECM不是僅起支架作用的雜亂無章的靜态堆積物質，而是組織有序、生物學活性多樣的生命大分子。它們對細胞和組織的形态結構、新陳代謝、生長、分化都有重要影響。

　　（一）膠原

　　膠原（collagen）是細胞外基質的最重要成分，目前已發現至少19型膠原，但肝髒中含量較高者僅包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅹ和Ⅷ型。正常人肝髒的膠原含量約爲5mg/g肝濕重，Ⅰ/Ⅲ型膠原的比爲1：1，各占33%左右；肝纖維化和肝硬化時肝髒膠原含量可增加數倍，且Ⅰ/Ⅲ型的比值可增加到3：1左右。根據膠原的結構和功能可将其分爲7類：

　　1.纖維性膠原（fibril　forming　collagen）    這是最經典的膠原，如Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ和Ⅺ型膠原。其肽鏈長達1000個氨基酸，是結締組織中含量最豐富的膠原。前膠原三螺旋的端肽被切除後縱向平行排列，其中每個膠原分子縱向稍偏移，相鄰的肽鏈形成共價鍵交聯從而形成微纖維。一般需經前膠原肽酶（procollagen　propeptidase）将羧基端肽去除後才能形成膠原纖維，但是部分膠原可以帶有氨基端肽而存在于膠原纖維的表面，以阻止膠原纖維繼續增粗，從而繼續起到調節膠原纖維直徑的作用。

　　2.網狀膠原（network　forming　collagen）    如Ⅳ、Ⅷ和Ⅹ型膠原，主要分布于基底膜中。與纖維性膠原不同，其端肽不被去除。兩條Ⅳ型前膠原肽鏈的羧基端肽（NC1）端-端相連形成二聚體，四條前膠原肽鏈的氨基端肽（7S）端-端形成四聚體，從而相互交聯成三維網狀結構。在肝髒中，Ⅳ型膠原主要分布于血管和膽管的基底層，而且還分布于彙管區的成纖維細胞周圍及正常肝血窦的Disse腔中。Ⅷ型膠原常與彈性纖維一起分布于肝髒的彙管區和包膜中，其功能尚不清楚。

　　3.微絲狀膠原（microfilament　forming　collagen）     目前此組隻包括ⅥM型膠原。其膚鏈較短，僅爲纖維性膠原的三分之一左右。兩條膚鏈反向平行排列，借端膚相互交聯成二聚體，二聚體冉端-端相連聚集成四聚體。許多四聚體端-端相接形成狀如串珠的微絲狀長鏈。在肝髒中Ⅳ型膠原分布于彙管區基質和肝血賣Disse腔隙。Ⅵ型膠原通常分布在Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維之間，推測其功能是将血管結構錨定到間質中。最近發現Ⅵ型膠原對多種上皮細胞和間質細胞包括肝髒星狀細胞的生長有促進作用，并可抑制細胞凋亡。

　　4.錨絲狀膠原（collagen　of　aachoring　filament）Ⅶ型膠原屬此組，其肽鏈三螺旋長達1530個氨基酸，中間穿插許多非膠原序列。兩條前膠原肽鏈的羧基端肽端-端重疊交聯形成二聚體，多個二聚體以羧基端交聯區爲中心側-側聚集成錨絲狀纖維。這一纖維的兩個氨基端肽連接到基地膜的某種分子上起錨定作用，故名。

　　5.三螺旋區不連續的纖維相關性膠原（fibril　associated　collagens　with　intenrupted　triplehelices；FACIT）這一組包括Ⅸ、Ⅻ、ⅩⅣ、ⅩⅥ及ⅩⅨ型膠原，而且其數目還不斷增加。其本身不形成纖維，但與纖維性膠原纖維的表面相連。目前對這一組膠原的确切功能及組織、細胞分布尚不了解。ⅩⅣ型曾被稱爲粗纖維調節素（undulin），但現在認爲其特征性結構爲膠原三螺旋，故名ⅩⅣ型膠原。

　　6.跨膜性膠原（transmembrane　collagen）    如ⅩⅦ型膠原，它有一個細胞内非膠原區，一個跨膜區和細胞外膠原尾巴。這種膠原主要由皮膚基底角化細胞産生，在肝髒中未發現。

　　7.尚未分類的膠原：包括ⅩⅢ，ⅩⅤ和ⅩⅧ型膠原。ⅩⅢ型膠原主要分布于皮膚附屬器、骨、軟骨、橫紋肌及腸道黏膜，但不見于肝髒。ⅩⅤ型膠原mRNA表達于許多組織和器官的成纖維細胞和上皮細胞。ⅩⅧ型膠原主要分布于肝髒、肺髒和腎髒。值得一提的是，原位雜交研究結果表明在肝髒中ⅩⅧ型膠原主要由肝實質細胞産生，顯然與其它膠原主要由間質細胞産生不同。其羧基端具有抑制血管增生的作用而稱爲内皮抑素或内皮它汀（endostatin），初步體外和動物試驗發現它對腫瘤有較強的抑制作用。

　　（二）非膠原糖蛋白

非膠原糖蛋白（noncollagenous　glycoproteins；GP）    爲細胞外基質的另一重要成分，是一組在側鏈N或O位帶有糖基的蛋白分子，其分子中的多個功能區可與其它細胞外基質及多種細胞膜的跨膜蛋白受體結合，從而影響細胞的生長、分化、代謝等各種生物學行爲。随着對其生化組成和分子結構的研究不斷深入，目前已經很難截然區分膠原和非膠原糖蛋白及其它細胞外基質分子。如前所述，原來認爲粗纖維調節素（undulin）屬于糖蛋白，但現在認爲應該屬于膠原（ⅩⅣ型）。

　　1.纖維連接蛋白（fibronectin）　　纖維連接蛋白爲二聚體，其兩條鏈在羧基端有二硫鍵相連。其分子由多個功能區組成，可分别與細胞表面、細胞外基質分子（膠原、跨膜蛋白多糖、肝素及纖維蛋白原）及其受體完整素（intergrin）結合。它的分布十分廣泛，幾乎可見于所有的結締組織。其功能也多樣而且有的相互抵觸，如細胞黏附、伸展及移行。纖維連接蛋白的基因含有許多個外顯子，其新生RNA通過不同的剪接可表達出20種不同的mRNA并翻譯出相應的肽鏈，因而從理論上可形成400種不同的二聚體，可能這種高度多樣性正是爲了适應不同組織器官在不同生理或病理生理狀态下的功能需求。

　　細胞性纖維連接蛋白爲不溶性多聚體，由間質細胞産生，其特點是帶有一額外功能區 （extradomain）A或B，前者的功能爲促進與細胞的結合，後者的功能爲松解細胞與間質的結合而促進細胞的移行。它通過其細胞結合功能區與細胞表面的受體完整素結合，同時通過其它相應的功能區與膠原纖維、肝素等其它細胞外基質成分結合。它不僅像鉚釘一樣把細胞外間質連接成一體，而且通過完整素等分子與細胞骨架肌動蛋白相聯系，這可能是細胞與細胞、細胞與基質之間傳遞信号的一種重要方式。

　　血漿性纖維連接蛋白爲可溶性的二聚體，主要由肝細胞産生，其血漿濃度可達200-400mg/L。它們不含額外功能區，其亞單位的變化也不像細胞性纖維連接蛋白那樣大。在組織損傷時，纖維連接蛋白與纖維蛋白結合并沉積于局部作爲最早期的細胞外基質以促進修複。另外，纖維連接蛋白可與纖維蛋白、組織碎塊、細菌等結合然後被單核吞噬細胞清除從而起到調理作用。

　　2.層連蛋白（laminin）　　層連蛋白是上皮、内皮、肌肉、神經等細胞和組織的基底膜之主要成分，其功能多樣，包括維持細胞生長、分化和基因表達及細胞移行和腫瘤轉移。它由α（約440000）、β（約220000）和γ（約210000）三個亞單位（以前分别稱爲A，B1和B2）構成。三個亞單位形成十字架結構，它們的氨基端分别形成三個短臂，其羧基端并列在一起形成長臂，在十字架中部和長臂末端有二硫鍵将三條鏈連接在一起。這些亞單位由不同的基因編碼，現已知至少有5種α鏈，3種β鏈和2種γ鏈；它們可以組合成11種層連蛋白，其中1至7已得到證實。短臂可分爲球形功能區Ⅳ（在β鏈中稱爲Ⅳ’）和Ⅵ及杆狀功能區Ⅲ和Ⅴ。Ⅳ區的功能尚不清楚，Ⅵ對于層連蛋白形成多聚體至關重要，可能還具有結合肝素和細胞表面的位點。Ⅲ和Ⅴ區含有表皮生長因子樣重複序列；另外小鼠α1和β1鏈的Ⅲ區分别含有YIGSR（酪-異-甘-絲-精）和RGD（精-甘-門）序列（均爲細胞表面結合位點），γ1鏈Ⅲ區含有結合巢蛋白的位點，可能在基底膜中把層連蛋白和Ⅳ膠原連成網狀結構。長臂可分爲杆狀功能區Ⅰ和Ⅱ，其中可能有細胞結合位點。另外α鏈羧基末端球形結構爲功能區G，其中含有結合肝素、硫酸乙酰肝素、蛋白多糖及細胞表面的位點；功能區B爲β鏈長臂中部一小的環狀結構，它将功能區Ⅰ和Ⅱ分開，其功能尚不清楚，但推測可能對層連蛋白鏈的選擇和組裝過程中起作用，或者連接層連蛋白和其它基底膜成分。

　　3.巢蛋白（entactin，nidogen）    爲基底膜的成分之一，其分子量爲150000。可分爲三個功能區，兩端分别爲呈球形的氨基末端Ⅰ區（較大）和羧基末端Ⅲ區（較小），及二者之間呈杆狀的Ⅱ區，因而整個分子裏不對稱啞鈴形。Ⅱ區主要由富含半胱氨酸的表皮生長因子樣重複序列和甲狀腺球蛋白樣重複序列組成，它可結合鈣離子并促進細胞黏合，但其主要功能是促進基底膜的裝配。其羧基端球形Ⅲ區可與層連蛋白γ1短臂之Ⅲ區緊密結合，同時這一區還可與Ⅳ型膠原的羧基端肽80nm處結合，在層連蛋白和Ⅳ型膠原之間起橋梁作用。

　　4.健生蛋白（tenascin，hexabrachion，brachionectin，cytotactin）　　腱生蛋白家族至少有三個成員，即t-C，t-R，t-X，它們爲不同的基因産物。t-R主要分布于神經系統，t-X主要分布于骨骼肌和心肌；而t-C被發現最早，也是通常所指的腱生蛋白，它分布于多種發育中的組織，包括神經組織，但不見于骨骼肌和心肌。腱生蛋白基因通過不同的RNA剪接而形成的六個亞單位，它們的氨基末端在中央由二硫鍵連接而形成六聚體。每一長臂帶有與纖維連接蛋白（Ⅲ區）樣和表皮生長因子樣的同源序列，在近羧基端有細胞結合位點。它可通過與纖維連接蛋白上的同源序列競争細胞受體而幹擾和減弱其黏附功能。它和骨連接蛋白（osteonectin）及血小闆反應蛋白（thrombospondin）均有促進細胞運動的功能，故有人将這三者稱爲“抗黏附分子”（anti-adhesive　molecules）。有研究發現，腱生蛋白-C基因敲除（knockout）小鼠發育生長正常，因而有人認爲此分子可能無功能。但另一種可能的解釋是，同一基因家族的其它基因可能起到了補償作用才使小鼠發育正常。在正常肝髒中，僅少量腱生蛋白沿肝血窦斷續分布，而肝纖維化時大量腱生蛋白沉積在結締組織和肝實質細胞交界處；雙重免疫組化技術顯示肝星狀細胞合成和分泌腱生蛋白，來自肝實質細胞的細胞系在體外培養中不産生腱生蛋白。

　　5.富含半胱氨酸的酸性分泌性蛋白（secreted protein，acidic and rich in cysteine；SPARC）　　曾因最早發現于骨組織中而又稱骨黏連蛋白（osteonectin）；因其分子量爲40000且可由小鼠分泌基底膜性腫瘤（basement　membrane-secreting tumor）産生，故又名BM40。SPARC可分爲4個功能區，Ⅰ和Ⅳ區具有結合鈣的位點，Ⅱ區與絲氨酸蛋白酶抑制物（serpin）、濾泡素抑制素（follistatin）有同源性，Ⅲ區爲α螺旋結構。其含量在骨組織與血小闆及成纖維細胞中較高。Nortliern　blot結果表明現在人、大鼠和小鼠肝硬化肝組織中SPARC　mRNA水平較相應正常肝組織明顯升高，且随肝纖維化的消長而同步變化，組織原位雜交及體外細胞培養研究發現肝髒星狀細胞是SPARC的主要細胞來源。其功能較爲複雜，包括幹擾細胞與細胞外基質的結合而改變細胞的形狀、促進其移行，對血管增生和腫瘤轉移的影響也已有許多報道。值得注意的是，它可以與血小闆衍生的生長因子（PDGF）的β鏈結合而抑制其活性，因而似乎能夠對抗其促進星狀細胞增值和激活。但是另一方面，它還可以誘導Ⅰ型血漿纖維蛋白酶原激活因子的抑制物，因而可能抑制細胞外基質的降解過程。因此SPARC在肝纖維化、肝硬化的發生和發展中的确切作用尚有待深入研究。

　　6.血小闆反應蛋白（thrombospondin；TSP）　　血小闆反應蛋白爲一基因家族，已發現了至少5種TSP，TSP1、2由3條相同的鏈經二硫鍵連接而成，TSP3、4、5由5條相同的條鏈經二硫鍵連接而成，呈扁橢圓形的“流星錘”樣。最早發現于血小闆的顆粒内，在血小闆激活時釋放出來。後發現許多增殖中的細胞也産生TSP，包括成纖維細胞、内皮細胞和平滑肌細胞。TSP分子中有許多結合位點，包括細胞表面，鈣離子，纖維連接蛋白，層連蛋白，Ⅰ、Ⅴ型膠原，以及纖維蛋白原、纖溶酶原等。TSP對細胞增殖有輕度刺激作用，TSP1可能是TGF-β1在體内的激活劑。缺乏TSP2的小鼠之皮膚和肌腱發脆、強度降低，說明它對于膠原纖維的形成起重要作用。PDGF和bFGF及血清可以促進TSP的表達。對于腫瘤生長的作用，目前有兩種截然不同的觀點，即促進和抑制腫瘤。

　　7.玻連接蛋白（vitronectin）　　玻連接蛋白也是一種細胞黏附和伸展因子，存在于血漿和ECM中，由單體和二聚體兩種形式。它可以和完整素受體結合，也可以和補體及凝血過程後期的一些蛋白結合，抑制細胞溶解。在止血、細胞吞噬、組織修複及免疫應答中起保護作用。主要由肝髒合成，但血小闆、巨噬細胞和平滑肌細胞也可合成。在正常肝髒中，僅在彙管區見少量玻連接蛋白染色。而在慢性肝炎、肝硬化患者血清中玻連接蛋水平降低，但肝組織中玻連接蛋沉積增多，且主要分布于纖維間隔和竈狀壞死區。免疫電鏡觀察提示玻連接蛋由肝細胞産生。

　　（三）蛋白多糖

　　蛋白多糖（proteoglycan）    是一類由蛋白質作核心骨架，在N或O位上連有糖胺多糖（glycosaminoglycan；GAG）側鏈的大分子物質，它們與膠原一起分布于細胞外基質和基底膜上，同時也分布于細胞膜上。以前根據其糖胺多糖的不同分爲硫酸乙酰肝素（heparan　sulfate）、硫酸皮膚素（dermatan　sulfate）、硫酸軟骨素（chondroitin　sulfate）及硫酸角質素（keratan　sulfate）。正常肝髒中硫酸乙酰肝素含量最多，而肝纖維化時而硫酸皮膚素和硫酸軟骨素的含量增加。透明質酸（hyaluronic　acid）沒有經過硫化，也無蛋白骨架，但通常也與蛋白多糖一起被描述。近年傾向于根據其糖核心蛋白不同進行分類：

　　1.與細胞膜相關的蛋白多糖  其核心蛋白往往有跨膜功能區，有的則經其GAG側鏈與細胞膜相連。它們含有大量的硫酸乙酰肝素和少量的硫酸軟骨素，可與細胞外基質、生長因子、細胞黏附分子（CAM）及蛋白酶抑制物結合，能調節這些物質的活性。

　　（1）黏連蛋白聚糖（syndecan）：它是某些細胞外基質的受體，通過其GAG側鏈可與Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型膠原、纖維連結蛋白及腱生蛋白相結合；同時還是bFGF的輔助受體（coreceptor）。其主要功能是信号傳遞，它可由肝組織及體外培養中的肝細胞産生。

　　（2）凝血調節蛋白聚糖（thrombomodulin）：由血管内皮細胞産生，其GAG側鏈爲硫酸軟骨素。可與凝血酶結合，抑制纖維蛋白原和因子V的激活，從而調節血液凝固過程。

　　（3）蛋白聚糖（betaglycan）：其GAG側鏈爲硫酸軟骨素和硫酸乙酰肝素。是細胞膜受體，對TGF-β有高親和力，是它的Ⅲ型受體。

　　2.與細胞外基質相關的蛋白多糖  它們主要分布于細胞外基質中。

　　（1）纖調蛋白聚糖（fibromodulin）：其GAG側鏈爲硫酸角質素，可以調節膠原微纖維的形成。在肝髒中尚未發現。

　　（2）基底膜蛋白聚糖（perlecan）：由非實質細胞産生，分布于基底膜和膽管、血管。可與内皮細胞和肝細胞結合。

　　（3）核心蛋白聚糖（decorin）：其GAG側鏈爲硫酸軟骨素和硫酸皮膚素。可與Ⅰ、Ⅳ膠原及纖維連結蛋白結合，延緩膠原微纖維的形成。它對調節TGF-β的生物活性有較大的作用。首先TGF-β可使核心蛋白聚糖的表達增加，而核心蛋白聚糖又反過來可使TGF-β滅活。在正常情況下星狀細胞富含視黃酸，其核心蛋白聚糖表達較高，TGF-β的活性受到抑制；而在激活的星狀細胞中視黃酸含量減少，核心蛋白聚糖的表達亦降低，因而對TGF-β的抑制作用減弱，更有利于纖維增生。

　　（4）雙糖鏈蛋白聚糖（biglycan）：其GAG側鏈爲硫酸軟骨素和硫酸皮膚素，由星狀細胞和肌成纖維細胞合成。通過其核心蛋白與TGF-β結合，通過其GAG與bGFG結合。與核心蛋白聚糖相反，TGF-β可使其表達增高，而視黃酸可使其表達減低。

　　（5）多功能蛋白聚糖（versican）：其側鏈爲硫酸軟骨素，PDGF和TGF-β可使其表達增加。它可與透明質酸結合。至于肝髒細胞是否可産生多功能蛋白聚糖尚無定論。

（四）細胞-基質黏附分子

廣義的ECM還包括細胞-基質黏附分子（cell-matrix　adhesion　molecules）。細胞和細胞外基質成分之間的相互作用就是通過特定的質膜蛋白（即各種黏附分子）來實現的。一些在其它上皮細胞和内皮細胞上經常表達的黏附分子，在正常肝細胞和血窦内皮細胞中并不表達，但在纖維化的發生過程中這些黏附分子的表達增加。細胞-基質黏附分子主要包括整合素（integrin）家族和CD44蛋白家族。

1.整合素  整合素是由α和β鏈非共價結合組成的二聚體，現已知有17種α鏈和8種β鏈共組成21種有功能的二聚體。作爲受體整合素可以結合多種配體，而一種細胞外基質成分可由多種整合素通過不同的識别位點結合。最重要的識别位點是細胞外基質分子中的R-G-D（精-甘-天）序列，大多數整合素受體皆可識别之。各種整合素有其特定的組織分布，但一種細胞可以存在多種整合素，其配體識别位點亦可有重疊。在非極性細胞上，整合素分布于各個面，在極性細胞隻分布于基底面和側面。它們不僅起黏附作用，而且因其細胞内功能區與細胞骨架相連，故可以傳遞信号，促進細胞的增殖、分化和移行。

2.CD44蛋白家族 這是一類大量糖基化的跨膜蛋白，廣泛分布于體細胞，可以介導細胞-細胞，細胞-間質的相互作用。本家族的成員很多，在正常狀态下，肝細胞内檢測不到CD44蛋白的表達，但在血窦内皮細胞中可有表達。

黏附分子在肝纖維化過程中最顯著的改變是肝細胞和血窦内皮細胞誘導表達層連蛋白受體（屬整合素家族），而且其表達的上調早于肝硬化的形成。緻纖維化的細胞因子如TGF-β和促進炎症的細胞因子如TNF-α、IL-1β、IFN-γ均可促進整合素和CD44蛋白的高表達。完整素受體的激活可以直接和間接地觸發一系列的細胞内事件，如細胞的形态、分化、代謝、分泌、胞漿底物的酪氨酸磷酸化等，再次說明細胞外基質對于調節肝細胞和血窦内皮細胞的結構和功能起重要作用。在肝纖維化的早期，整合素的表達能促進細胞外基質在局部的沉積和排列，因而這種黏附分子表達增強的現象不僅是機體對細胞微環境改變的被動适應，而且有可能在啓動纖維化本身的過程中起主動作用。