HBV感染綜合免疫療法

   全國HBV感染率近60%，其中HBsAg攜帶率爲10%，大約有1.2-1.3億人，現症患者3千多萬，是我國肝硬化和肝癌的主要原因。乙型肝炎爲危害我國人民身體健康的主要疾病。慢性乙型肝炎(CHB)采用抗病毒、調節免疫、改善肝功能和抗纖維化等綜合處理，已爲傳染病醫務工作者所接受。但目前抗病毒藥物效果尚不能令人滿意，檢測手段落後，對患者免疫狀況缺乏簡單、準确和可靠的檢測方法，以及缺乏從辯證觀點看問題等諸多問題，往往出現顧此失彼、盲目用藥的現象。如何根據臨床、化驗、機體免疫狀況、綜合分析、抓主要矛盾，個體化用藥，制定合理的治療方案，提高治愈率是至關重要的。
    一、乙肝病毒感染的自然病程：
    HBV感染可産生各種臨床表現，從無症狀的自限性感染到症狀明顯的各期肝病如急性肝炎、重型肝炎和肝硬化等。我國HBV感染率近60%，約1/3-1/2爲亞臨床感染，大多數表現爲一過性自限性感染，不知不覺病毒清除而獲得痊愈，僅少數出現明顯的臨床症狀。感染HBV後，約90-95%可完全康複。轉爲慢性感染者也不過10%。新生兒、嬰幼兒獲得感染，由于免疫功能不健全表現爲免疫耐受。HBV感染持續存在而任何臨床表現(症狀、肝功等)。我國HBV感染率明顯高于西方國家。大約50%系在新生兒、嬰幼兒期甚至宮内獲得。多屬垂直傳播(母嬰或父嬰，以母嬰傳播爲主)。大多數将成爲慢性HBV感染者，相當一部分演變爲肝硬化甚至肝髒細胞癌。感染後由于處于免疫耐受期(大約20-30年)而無任何臨床表現即所謂的HBsAg攜帶者。經典的Burwet克隆選擇學說認爲，免疫耐受是指機體在胚胎期免疫功能成熟之前，接觸外來抗原(如病毒)，機體視其爲自身物質，針對該抗原起特異性反應的淋巴細胞克隆消失，不産生免疫應答。近來研究發現，新生兒、嬰幼兒與發生免疫耐受的機制不同。新生兒和嬰幼兒免疫耐受機制：
    1．經胎盤感染：過量的抗原表達，HBeAg在胚胎期進入胎兒體内，引起針對HBV的T細胞克隆缺失。
    2．抗原提呈細胞-DC功能下降：DC是體内最強的抗原提呈細胞，是唯一可直接活化T細胞的APC。70年代Steinman首次報導了DC，1992年從外周血分離培養出DC。DC在感染性疾病研究中受到越來越多的關注。研究表明GM-CSF(重組粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子)IL-4及腫瘤壞死因子等促進DC的分化，成熟。實驗證明DC在免疫激發中有顯著的作用。成熟的DC可高度表達MHC-I、II分子，提高刺激信号(CD80、CD86)及粘附分子，引起強烈的細胞免疫，達到清除病毒。有人在轉基因小鼠實驗中發現，DC的MHC-II和CD80表達極低。MHC-I類分子也明顯低下，從而清除HBV能力下降。
    3．Th性T細胞應答功能低下。
    期發生感染其免疫耐受形成可能爲：
    ①大量的病毒導緻抗病毒CTL麻痹。
    ②抗病毒CTL由于對抗原的過強增殖反應而發生凋亡。
    ③抗原提呈細胞功能低下。耐受期過後或由于藥物、飲酒等影響和機體免疫因素的原因，可突然出現肝炎的臨床表現，酷似急性肝炎，如不仔細分析，錯診爲急性肝炎。有人報告臨床診斷的急性肝炎與肝活檢結果的符合率不過50%。應引起臨床的重視。
    二、抗病毒和免疫治療應綜合分析
    CHB慢性化的主要原因是宿主體液免疫、細胞免疫反應低下或無反應，緻使HBV感染長期存在。肝髒細胞的炎症、壞死、纖維化等，雖不是HBV本身造成，但HBV可激發人體的免疫應答。所以HBV感染治療的關鍵是抗病毒和調節免疫機能。目前公認的抗病毒藥物有幹擾素和賀普丁。幹擾素有抗病毒、抗腫瘤和調節免疫的作用，而賀普丁爲抑制逆轉錄酶活性，從而使雙鏈DNA不能合成，而達到抑制病毒的作用。以上二藥理想的适應症均爲ALT升高伴有乙肝病毒複制指标(HBeAg和HBV-DNA)陽性的病人。完成全療程達到完全應答(ALT複常，HBeAg和HBV-DNA陰性，抗-HBe陽轉)者，IFN近期療效不過30-50%。而且副反應亦頗多。賀普丁爲核苷類藥物，對HBV-DNA抑制率高(85%±)效果好，但停藥後重新複制，HBeAg陰轉率很低。姚光弼報告用藥一年HBeAg陰轉率9.5%，達到完全應答者8.5%，用藥滿二年分别爲16.8%和11.5%。連續用藥容易出現YMDD變異。1-4年治療，變異率分别爲14%、38%、49%、66%，随用藥時間的延長，變異率逐漸增加，而且該藥物對HBV複制模闆cccDNA無作用。抗病毒治療停止，血HBV-DNA會再次出現。從理論上講，要做到病毒的徹底清除，要有長療程抑制HBV-DNA的合成和清除cccDNA。治療的時間要持續到cccDNA庫存在的期限那樣長。有人研究感染HBV的肝細胞的半衰期達100天，治療一年能夠減少感染細胞的數量最高是原始量的8%。這樣長期的抗病毒治療。将導緻HBV的變異，副反應增多，價格昂貴也是一個現實問題。所以，目前使用的抗病毒藥物不能令人滿意。還需廣大醫務工作者、研究者努力探索，發掘祖國醫學寶庫，尋找更有效、适合我國國情、價廉、藥源廣、療效高的藥物。此外，我國尚有1.3億的HBsAg攜帶者存在，這部分人群處于免疫耐受期，對HBV無反應性。對它們首先不是使用抗病毒藥物，而是調節免疫打破免疫耐受，再結合抗病毒藥物，可能會取得更好效果。2000年6月在日本召開的亞太國際肝病學術會議将CHB免疫病理分爲三個階段，即免疫耐受期、免疫清除期和病毒殘留期。SALT正常而HBV高水平複制爲免疫耐受期，SALT明顯升高或反複波動爲宿主免疫系統已識别并開始攻擊肝細胞。SALT正常，HBV低水平複制爲病毒殘留期。2000年5月美國内科學會，在“慢性乙型肝炎感染，下一個千年的策略”文章中指出：慢性乙型肝炎治療策略應當爲抗病毒治療+特異性免疫性治療+非特異性免疫治療的聯合療法。在我國慢性HBV攜帶者爲數衆多，免疫耐受期多不主張首先抗病毒治療。當從免疫耐受期進入免疫反應期肝髒炎症活動，ALT升高。免疫反應過強，可導緻肝衰竭。可采用高效價乙肝免疫球蛋白，中和HBV，減少複制水平，同時采用抗病毒藥物，拉米呋啶和/或磷甲酸鈉。爲緩解非特異性免疫反應及病毒血症，也可用甘草甜素與胸腺肽聯合應用。當免疫反應功能存在但尚不能清除病毒，病情遷延不愈時，這種難治性CHB單一使用調節免疫藥物或抗病毒藥物，效果不會理想，可采用聯合用藥治療。如大劑量乙肝疫苗+佐劑+抗病毒藥物治療難治性CHB病例。因此，應根據患者的不同免疫狀況和HBV複制水平，決定抗病毒和免疫治療的主次或聯合治療。這方面我國學者已做了些探索和研究，取得了一定效果。北京醫科大學感染科田庚善教授與北京地區其他專家共同制定的“左旋咪唑+潘生丁+乙肝疫苗”三聯療法。價格便宜，對HBeAg、HBV—DNA陰轉都有一定的作用。解放軍458醫院全軍肝病中心張宜俊等人根據患者的不同免疫狀況，采用免疫療法與抗病毒相結合、特異性免疫與非特異性免疫藥物相結合，促進樹突狀細胞與T-細胞功能相結合的治療方法，也取得了較好的效果。
    三、CHB的免疫治療
    (一)特異性免疫增強劑——乙肝疫苗：
    乙肝疫苗接種是預防HBV的根本辦法。國内廣泛開展乙肝疫苗接種，使HBsAg攜帶率顯著降低。上海由10.0%降至0.53%，北京由7.07%降至0.41%。這是乙肝防治工作的一個了不起的成績。若幹年之後我國HBV感染将會大幅度下降，達到控制或基本控制。能否用乙肝疫苗治療HBV的感染，能否提高細胞免疫功能達到清除HBV的目的？目前國内外學者都在進行治療性乙肝疫苗的研究。主要有HBsAg疫苗、HBsAg/前S疫苗、HBsAg複合物疫苗和HBV-DNA疫苗。這些疫苗多以HBsAg爲主要免疫原。已有人将HBsAg疫苗用HBV轉基因鼠，可使HBeAg和HBsAg轉陰率大大提高。這些疫苗許多尚處于研制階段，其中以HBsAg蛋白疫苗最有實用價值。聞玉梅教授等在鴨乙型肝炎模型中以金葡菌爲固相基質吸附抗-DHBs，再吸附純化的DHBsAg組建固相基質-抗體-抗原複合物(SMAA)來免疫DHBV感染鴨，每3周一次，共3，60-80%鴨DHBV-DNA轉陰，50-60%DHBsAg轉陰，并有部分鴨産生抗-DHBs。國外學者應用抗原抗體複合物(DHBsAg-抗-DHBs)免疫DHBV感染鴨，也使50%鴨清除血清中DHBV-DNA及DHBsAg，并認爲不加佐劑的抗原抗體複合物免疫可使小鼠對相應抗原産生強烈的體液和細胞免疫。應用國産血源乙型肝炎疫苗與人乙型肝炎免疫球蛋白組成HBVac-HBIg疫苗(每單位含HBsAg60μg和HBIg38μg，以氫氧化鋁爲佐劑)接種14例CHB患者，每3周一次，共3次，6個月後有9例(64.3%)血清HBV-DNA轉陰，6例(42.9%)HBeAg轉陰。所有接受治療者均未出現免疫複合物相關疾病的症狀。實驗證明，小劑量HBsAg疫苗(5-10μg)可誘導體液免疫應答，産生保護性抗體，實用于預防乙型肝炎，而大劑量(40-60μg)可誘導細胞免疫應答，有利HBV的清除。最近美國和澳大利亞分别批準以MF59爲佐劑(代替鋁佐劑)的乙肝疫苗與拉米呋啶聯合治療CHB。國内有人用大劑量HBsAg疫苗治療CHB病人取得較好療效。動物實驗證明，大劑量乙肝疫苗可增加T淋巴細胞增殖，誘導Th1型細胞産生IL-2和IFN-γ，并能促進與細胞免疫相關的抗-HBsIgG2a産生，提高CTL的免疫功能。爲乙肝疫苗治療CHB提供了理論依據。
    國内早在“七五”、“八五”期間，應用乙肝疫苗加豬苓多糖治療CHB取得了可喜的效果。但多年來乙肝疫苗應用缺乏科學的理論指導，使用方法缺乏規範化，劑量和療程不統一。各學者評價不一。張氏提出的加大乙肝疫苗劑量(60μg)和長療程(12個月)并聯合其它非特異性免疫增強劑治療CHB和HBsAg攜帶者的方案值得我們臨床進行驗證。
    關于大劑量乙肝疫苗注射的毒性作用。廣州解放軍四五八醫院全軍肝病中心易學瑞等人，以高劑量HBsAg疫苗對食蟹猴和小鼠中長期及急性毒性實驗研究。在小鼠長毒實驗中第三周起有個别動物頸背部(注射部位)有硬結。臨床長期使用應引起注意。給藥組動物可對受試疫苗産生免疫應答反應，血清中可檢測到對應的抗體，部分動物可檢測到IgG2a，停藥4周，抗HBs仍然存在，IgG2a水平升高。劑量達6μg/隻(約相當于300μg/kg，單次劑量爲單次人臨床拟用量的300倍，以體表面積計，約爲單次人臨床拟用量的24倍)。可對動物的肝功能有一定影響。未見明顯遲發性毒性反應。本品多次給予小鼠(連續21次)的最大無毒作用劑量爲3μg/支(約相當于150μg/kg)。單次劑量約爲單次人臨床拟用量的150倍。以體表面積計，約爲單次人臨床拟用量的12倍。以相當人臨床用藥量的42倍給食蟹猴注射，肝、腎出現輕度損害，停藥可恢複。對食蟹猴的最大無毒作用劑量，相當人臨床拟用量的21倍。實驗結果提示60μg的乙肝疫苗在對人體是安全的。到底反應如何還有待今後進一步研究。
    (二)非特異性免疫增強劑
    1．胸腺肽——α1()
    爲28個氨基酸組成的，人工合成，提高。據廠家介紹可增加内源性IFN-α和γ的分泌，提高IL-2水平和增加IL-2受體對IL-2的親和力，增加淋巴細胞(CD3、CD4、CD8)的産生、分化和活化，可用于乙肝的治療，但也有相反的報告。該藥價格昂貴、效果一般，不适合我國國情。
    2．國産胸腺
    化學合成，分子量679，有促進和抑制雙向調節作用，使免疫功能趨于正常。免疫增強作用表現爲提高脾淋巴細胞E玫瑰花結形成率，增加巨噬細胞的吞噬功能，升高循環抗體的含量，活化CD4和CD8，增加CTL活性增加細胞内IFN的産生，可用于CHB的免疫調節治療。國内有人用胸腺肽治療CHB，60-80%患者的症狀消失，肝功能試驗複常，部分患者HBsAg陰轉。應用胸腺肽與IL-2治療CHB，結果聯合組HBeAg、抗-HBcIgM和HBV-DNA的陰轉率均高于對照組和單用胸腺肽或IL-2組。張氏采用大劑量(160μg)靜脈點的方法，HBeAg和HBV-DNA陰轉率均高于小劑量組。胸腺肽一般無明顯不良反應，少數患者出現過敏反應，有寒戰、發熱、皮疹和皮膚瘙癢等。目前的問題是生産廠家諸多，國家缺少嚴格的規範标準，産品質量好壞不一，給臨床帶來困難。
    3、左旋咪唑
    全世界醫學家在70年代及80年代，對左旋咪唑進行了大量的臨床研究，證明是療效肯定的免疫調節劑。提高免疫缺陷小鼠的抗體生成量，活化T細胞及單核細胞。動物和人體試驗都證明能誘導IFN的産生。每天口服150mg3 -5天，有80%可見外周血單核細胞殺傷活性增強。慢性肝炎病人的NK細胞活性明顯低于正常人，使用左旋咪唑後使NK細胞活性由51.45%提升至64.11%。說明可增強機體的免疫功能，有利HBV的清除。
    因口服左旋咪唑副反應較大，使其應用受到限制。爲克服口服用藥産生的不良反應。我國已生産出經皮吸收的塗布劑。經幾年來的臨床使用，證明對CHB、流感、過敏性哮喘、皮膚扁平疣等病毒性疾病均有一定的療效。劉媛媛報告用左旋咪唑與一般保肝藥治療CHB 136例，療程6個月。單一保肝藥做對照。結果HBeAg、HBV-DNA陰轉率分别爲34.6%和41.3%。高于對照組。上海巫善明等報告CHB 117例，HBsAg、HBeAg、HBV-DNA有效率分别爲2.6%、35.1%、43%，亦優于對照組。還有用左旋咪唑+乙肝疫苗+潘生丁的三聯療法。北京軍區總醫院和商丘市第五人民醫院報告80例HBsAg攜帶者，使用三聯療法，觀察時間6－18個月。結果HBeAg、HBV-DNA陰轉率分别爲54.41%、66.18%，而對照組HBeAg陰轉率僅爲7.78%，還有人用塗布劑聯合拉米呋啶治療慢性乙型肝炎，可提高HBeAg的血清轉換率，值得臨床錯鑒和進一步驗證。
    4、微卡(M·Vaccae)
    微卡是我國1999年批準生産的國家二類新藥。它是用母牛分支杆菌經過高壓破碎、高溫處理制成的注射用凍幹粉針劑。母牛分支杆菌含有高濃度分支杆菌類共同抗原。對人和動物無緻病性。七、五期間，我國卡介苗和潘生丁聯用治療CHB，取得了較好的效果。該藥是有雙向調節作用。促進T細胞轉化及增殖，改善患者的細胞免疫功能，CD3、CD4升高，CD8降低，增強吞噬功能，但由于卡介苗是減毒分支杆菌的活菌苗，有效期短(3個月)。而且容易引起局部潰瘍、結痂及疤痕，因而限制了它的應用。微卡既克服了卡介苗的不良反應，又保持了其免疫刺激作用。成爲替代卡介苗治療CHB的藥物。
    5、綠膿杆菌菌毛制劑 (佰安)：
    綠膿杆菌菌毛制劑系一種非特異性免疫增強劑。在體外刺激淋巴細胞活化，促使PBMC表達CD2、CD25、CD69細胞明顯增加，若與HBsAg合用，對上述功能具有協同作用，此外類似佐劑，能促使HBsAg在多次高劑量免疫條件下誘生與細胞免疫有關的IgG2a類抗HBs。可活化T細胞功能。80年代—90年代大連醫學院微生物教研牟希亞教授，在艱苦的條件下反複實驗，制成了含有緣膿杆菌I、IV型菌毛的綠膿杆菌制劑。由南方某公司開發生産，商品名爲綠幕安注射液。實驗證明上述增強免疫的作用。我院在2000年使用綠幕安和綠幕安+1FN-α2b治療CHB 30例和HBsAg攜帶者89例，一般護肝爲對照，療程6個月。結果CHB和攜帶者組HBeAg、HBV-DNA陰轉率分别爲43%(13/30)、50%(15/30)和(29/89)32.7%，(35/89)39.3%，均優于對照組。證明了綠幕安的促進免疫反應的作用。後來海南微克西藥業有限公司又制成了含有I、II、IV型菌毛的綠膿杆菌制劑(商品名佰安)。因增加了II型菌毛成分，使其免疫效果較綠幕安更加明顯。張宜俊等人用佰安+乙肝疫苗+胸腺肽對在免疫耐期的HBV感染者42例進行治療。先用3－6個月的免疫治療，再加用拉米呋啶。結果HBeAg陰轉率、HBeAg/抗HBe轉換率，HBV-DNA陰轉率分别爲26.2%、19.1%和54.8%，較單用拉米呋啶的HBeAg(4.8%)陰轉率、血清轉換率0%和HBV-DNA(28.6%)陰轉率有明顯提高。提示三聯療法對啓動免疫，打破免疫耐受有一定作用。對免疫耐受期的HBV感染者的治療帶來一線希望。
    四、免疫療法方案
    摘自2003年元月廣州慢性乙型肝炎免疫治療學術研讨會論文彙編14頁。
    1、免疫耐受期：
    治療原則：先應用免疫療法3－6個月後，再應用抗病毒治療。
    免疫療法方案：乙肝疫苗+胸腺肽+黃芪注射液或乙肝疫苗+胸腺肽+含I、II、IV型菌毛的綠膿杆菌制劑(佰安注射液)
    乙肝疫苗60μg，肌注，每月1次×12。
    胸腺肽120mg加入10%葡萄糖液靜點，每周3次×3－6個月，或胸腺肽40mg，肌注每周2－3次×3－6個月。
    黃芪注射液40ml加入10%葡萄糖液靜點，每周3次×2－3個月。
    佰安注射液1ml，皮射，每周1次×3－6個月。
    抗病毒藥物：1FN-α或拉米呋啶(常規劑量及用法)。
    2、免疫清除期：
    治療原則：免疫療法+抗病毒藥物+護肝
    方案：乙肝疫苗+佰安注射液或胸腺肽+1FN-α或拉米呋啶+促肝細胞生長素
    3、病毒殘留期：
    乙肝疫苗60μg，肌注，每月1次×12－24個月。
    4、HBV-DNA、HBeAg、HBsAg檢測均采用定量分析，每3個月一次。