宮頸癌HPV疫苗的研究

    世界衛生組織的統計資料表明，宮頸癌在全球婦女癌症死亡率中位居第二，在一些發展中國家甚至居于首位；每年全球大約有50 萬例新發宮頸癌病例，約20萬人死于宮頸癌，其中，80％的死亡發生在發展中國家。據不完全統計，我國現有宮頸癌病人約13.8萬，每年約有 5萬人死于宮頸癌。大量研究資料證明，生殖道的HPV(人瘤病毒) 感染與宮頸癌有着十分密切的關系———約80％的宮頸癌與4種類型(16、18、31型和45型)的HPV 感染有關。其中，50％的宮頸癌與HPV16感染相關。目前，臨床上尚無預防HPV16感染的措施，而且對中晚期宮頸癌的化療和手術治療效果也不理想。宮頸癌的複發率較高且治療費用也高。在美國，每年用于宮頸癌篩查和治療的費用約爲5.7億美元。因此，研制高效、廉價的HPV疫苗，采用特異性的免疫接種方法預防和治療HPV感染及其所引起的惡性病變，對預防和治療宮頸癌有着十分重要的意義。

　　日前，在北京召開的“第一屆全國現代免疫診斷技術學術研讨會” 上，中國疾病預防與控制中心病毒所田厚文主任，介紹了HPV疫苗在防治宮頸癌中的作用和國内外HPV疫苗研究的最新進展。

　　HPV疫苗可引發機體的強烈免疫反應

　　田厚文主任介紹說，一般認爲，HPV最先感染表皮基底層細胞，并随着基質幹細胞向表皮細胞的分化，依次進行早期蛋白的表達、DNA複制和晚期蛋白的表達及病毒顆粒的裝配。HPV基因組DNA在宮頸癌細胞中大多以整合狀态存在，并在轉化蛋白E6和E7中大量表達，當病毒DNA整合後，就不再有病毒顆粒的産生。大量的臨床研究和實驗室資料表明， HPV宿主的免疫反應，對控制其HPV感染及相關病變具有十分重要的作用。大多數HPV感染者都可以自發清除其感染的HPV，而不會出現任何繼發病症，隻有持續性HPV感染才與宮頸病變密切相關。對已感染了HPV病毒并已引起相應疾病的個體，細胞免疫比體液免疫更爲重要。同時有研究發現，感染了HPV的CIN(子宮頸上皮内腫瘤)和宮頸癌患者體内，普遍存在對HPV的低免疫狀态。因此，有可能使用疫苗，特别是聯合免疫疫苗來刺激患者的機體産生強有力的免疫反應。這種聯合免疫能誘發機體産生針對HPV早期蛋白(E6和E7轉化蛋白)的細胞毒性淋巴細胞反應，從而将含有整合DNA的細胞或癌細胞殺傷，同時控制早期HPV感染的病毒增殖。它還能誘發機體産生中和抗體，以中和病毒，減少病毒感染細胞數，并幫助CTL(腫瘤特異性殺傷T淋巴細胞)更好地清除病毒感染。這種中和抗體主要由具有天然空間結構的病毒殼蛋白(HPV晚期蛋白)誘發。上述兩類免疫反應建立後，就能有效地清除已有的HPV 感染和手術後殘餘的癌細胞，以及預防HPV的再次感染，達到預防和治療宮頸癌的目的。

　　HPV疫苗分防、治兩類，其作用也有交叉

　　田主任說，由于HPV在體外難以培養和具有緻癌性，因此不大可能将完整的HPV的病毒顆粒制成疫苗，隻能研制基因工程疫苗。近十幾年來，HPV疫苗研究可以分爲兩類，即預防性疫苗研究和治療性疫苗研究。預防性疫苗一般以HPV16主要衣殼蛋白L1和次要衣殼蛋白L2爲靶抗原，其作用在于誘發機體産生特異性的中和抗體和有效的局部免疫反應，以阻止HPV的長期感染和再感染。HPV的衣殼蛋白在真核以及原核表達系統中表達時，能自我裝配或形成病毒樣顆粒(VLP)，其結構和抗原表位與天然的病毒顆粒十分相似。VLP能與細胞受體結合并進入細胞，這樣有利于抗原的加工呈遞以及誘發較強的細胞免疫。治療性疫苗通常是以經修飾後去除其轉化活性，但仍保留其抗原性的HPV1 6早期蛋白作爲靶抗原，它可誘導特異性的細胞免疫反應，被用于控制或消除感染HPV的良性和惡性病竈，并可作爲這類疾病的手術後的輔助治療。在大多數與 HPV16相關的宮頸癌及其癌前病變中，HPV16的E6和E7蛋白持續表達，而這種持續表達是腫瘤細胞轉化和維持惡性特征所必需的。并且，正常組織中不存在這兩種蛋白。因此，E6和E7蛋白就成爲HPV16相關宮頸癌及癌前病變治療性疫苗的理想靶抗原。對中晚期宮頸癌病人手術後殘留的腫瘤細胞，可應用這種治療性疫苗———通過激發病人的細胞免疫來殺傷、清除這些腫瘤細胞和已感染的上皮細胞，從而防止或限制腫瘤的複發和擴散。預防性和治療性HPV疫苗的作用也有交叉，如在良性疣和輕度CIN病變中存在HPV晚期蛋白的表達，預防性疫苗對這些疾病也有一定治療作用。近年研制的一些疫苗，如嵌合性疫苗、HPV假病毒疫苗等，同時具備預防和治療雙重作用。

　　多個HPV16候選疫苗已進入Ⅰ／Ⅱ期臨床試驗

　　田主任接着介紹了目前國際上已進入Ⅰ／Ⅱ期臨床試驗的幾種HPV16 候選疫苗的有關情況。

　　病毒樣顆粒疫苗研制HPV預防性疫苗常用的靶抗原，是HPV的主要衣殼蛋白L1蛋白和次要衣殼蛋白L2 。近十年來，人們研究較多的是利用昆蟲細胞、重組痘苗病毒以及沙門氏菌和大腸杆菌等的表達系統，來表達 L1蛋白和 L2蛋白。因L1和L2表達蛋白可自我裝配或經體外包裝折疊形成病毒樣顆粒，其有着與天然病毒顆粒十分相似的空間結構和抗原表位，且不含HPVDNA，所以，病毒樣顆粒疫苗被認爲是有前途的宮頸癌預防性疫苗。人們在多種動物模型實驗中都觀察到，經病毒樣顆粒免疫後，動物體内可産生高滴度的血清中和抗體，能保護動物免受HPV的實驗性攻擊。而且，這種保護作用可随着動物的血清傳遞。目前，人們對以昆蟲細胞表達的HPV16型L1病毒樣顆粒疫苗進行的Ⅰ／ Ⅱ期臨床試驗已經完成。試驗結果顯示，用病毒樣顆粒疫苗以肌肉注射途徑進行免疫，受試者中未見明顯毒性反應，其體内有較高滴度的中和抗體産生，其滴度比自然感染高約40倍。這種HPV16病毒樣顆粒疫苗Ⅲ／Ⅳ期臨床試驗的前瞻性研究，已在愛沙尼亞和北歐國家完成，其大規模的Ⅲ／Ⅳ期臨床觀察正在籌劃之中。

　　爲了研制既有預防效果，又有治療功能的HPV疫苗，最近幾年國際上已研究出幾種由L1衣殼蛋白和E7組成的E7嵌合病毒樣顆粒。這些嵌合病毒樣顆粒除能使機體産生中和抗體外，還能誘導機體産生較強的 E7特異性C TL反應和抗腫瘤活性，被認爲是最有前景的宮頸癌預防、治療性疫苗。這種疫苗有望用于治療已有HPV16感染的、有或沒有臨床症狀的病人。目前，一種包括HPV16型L1、L2和E7靶抗原的嵌合病毒顆粒疫苗(以昆蟲細胞表達) ，将要進入Ⅰ期臨床試驗。然而，由于以昆蟲細胞表達純化的病毒樣顆粒疫苗成本很高，受經濟條件限制，這種疫苗在發展中國家或落後地區不可能被廣泛應用。因此，必須尋找其它高效、廉價的腫瘤疫苗。

　　痘苗病毒載體疫苗曾用于消滅人類天花的痘苗病毒是最爲常用的病毒載體，其具有長期、大規模的人類接種史。同時，痘苗病毒感染率高，外源基因表達水平高，又爲裂解性病毒，其基因組與宿主細胞基因組整合的幾率非常小，因而無緻癌性擔憂。這些特性使痘苗病毒成爲腫瘤疫苗的合适載體。但痘苗病毒載體疫苗也存在着不足，其産生的并發症一 直阻礙着它的廣泛使用。此外，接種該疫苗後産生的抗痘苗病毒抗體可能抑制再次免疫，從而影響了它的免疫治療效果。重組痘苗病毒疫苗多爲活性重組疫苗，具有用量少、抗原不需純化等優點。用其免疫接種後，重組病毒在體内産生大量抗原，刺激機體産生體液免疫和細胞免疫。同時，病毒載體本身還可發揮佐劑效果。1996年，英國用表達HPV16型和 HPV18型的E6和E7蛋白以及重組痘苗病毒疫苗進行了宮頸癌治療的一期臨床試驗，沒有發現明顯的副作用，在部分受試病人體内可檢測到特異性抗體和CTL反應以及細胞因子，其在不同個體中的反應各不相同—— —這主要與癌症病期有關。近年來研制成功的非複制型痘苗病毒載體，除具有痘苗病毒載體的一般優點外，還具有在人體中不能繁殖後代，卻 能有效表達外源基因的優點，從而大大減少了免疫缺損病人在“種痘” 後出現并發症的可能性，使該疫苗用于人體更爲安全。由于其免疫效果不像活痘苗那樣依賴于病毒能否繁殖，因此有可能在一定程度上克服痘苗病毒載體疫苗存在的再次免疫效果不好的問題。用非複制型痘苗病毒載體構建的狂犬疫苗和HIV疫苗在國外也已進入人體試驗階段。我國在 “九五” 期間用非複制型痘苗病毒天壇株載體，成功研制了HPV16非複制型痘苗病毒疫苗。該疫苗在動物實驗中被證實具有特異性CTL反應和抗腫瘤移植反應。最近，我國有研究者将HPV16治療性重組痘苗病毒疫苗與蛋白疫苗聯合使用，獲得了理想的免疫效果。

　　疫苗在許多抗原研究中，由CTL識别的抗原決定簇被确定，這爲開發疫苗提供了可能。HPV16 型E6、E7在宮頸癌細胞中持續存在，被認爲是重要的惡性轉化因素。因此，用HPV16型E6或E7免疫，有可能加強腫瘤特異性CTL的産生。目前，人們已經發現了HPV16型 E6、E7抗原中的幾個能與人HLA-AⅡ 相配的CTL表位。用HPV型E7疫苗免疫HPV相關腫瘤這一方法，也已進入Ⅰ／Ⅱ期臨床試驗，試驗中未見其有明顯副作用。由于疫苗具有易于生産、價廉等優點，因此，疫苗有一定的應用前景。但疫苗由于受MHC- Ⅰ類分子的限制性影響，對于不同遺傳背景的個體需要使用與接種對象的HLA相匹配的疫苗。但目前除與人HLA -AⅡ相配的CTL表位外，人們對HPV16型E6、 E7抗原中與其它類型MHC-Ⅰ類分子相結合的CTL表位尚未明了，因此使得疫苗的應用受到較大限制。此外，合成肽疫苗的不足之處還在于其免疫源性不強，大多需要輔以強佐劑才能獲得有效免疫反應，這也影響了該疫苗的實際應用。

　　DNA疫苗DNA疫苗是将插入目的基因的表達質粒導入人體内，通過在人體内表達抗原而引起人體的特異性免疫反應。與其它疫苗相比，DNA 疫苗有許多優點，其中包括可以激發細胞免疫和體液免疫、易于構建和改造、易于制成多價疫苗、不需要佐劑、熱穩定性好、成本低廉等。目前，用于研制HPV治療性DNA疫苗的基因多爲HPV16型E 7基因。爲了獲得更好的免疫效果，可将E7基因進行一些修飾，從而增強MHC-Ⅱ類抗原的呈遞，提高細胞介導的免疫應答。動物實驗證明，用Sig／E7／LAMP1 融合基因制備的DNA疫苗，比采用野生型E7基因制備的DNA疫苗有更好的抗腫瘤效果。這一經肌肉注射途徑免疫的疫苗，其Ⅰ／Ⅱ期臨床試驗目前正在約翰霍普金斯醫院進行。值得指出的是，DNA疫苗在人體中免疫效果弱的問題及安全性問題尚待進一步解決。

　　我國HPV疫苗的研制已與國際接軌

　　田厚文主任最後介紹了我國在HPV研究方面的成果。他說，我國在 “九五”期間已将HPV疫苗的研制及應用作爲重點攻關課題。經過近5年的研究，我國在HPV疫苗的研制方面已經與國際接軌。在借鑒國外成功經驗的同時，我國在這方面的研究也取得了具有自身特色的研究成果。 “九五”期間，在HPV16預防性疫苗的研制方面，我國完成了 HPV16型L1 和L1／L2重組杆狀病毒疫苗株的構建，并在昆蟲細胞中進行了表達；在電鏡下觀察到病毒樣顆粒的形成；成功地構建了L1／L2均表達的重組複制型和非複制型痘苗病毒疫苗株。在HPV16治療性疫苗的研制方面，我 國已構建了表達HPV16型E6／E7蛋白的重組複制型和非複制型痘苗病毒疫苗株。經測試，這些疫苗株具有良好的免疫原性，可誘發特異性的CTL 反應，能夠保護C57小鼠抵抗TC-1腫瘤細胞的攻擊。與對照組相比，接種這種疫苗後，小鼠皮下成瘤時間延遲，荷瘤小鼠生存期明顯延長。研究人員用這種HPV治療性疫苗對腫瘤術後小鼠進行免疫治療時發現，這種疫苗能有效預防小鼠的腫瘤複發，說明該疫苗可作爲HPV16相關腫瘤及癌前病變的免疫治療候選疫苗。尤其是該疫苗在殺傷腫瘤手術後殘餘的或已轉移的腫瘤細胞上，以及在防止腫瘤轉移上具有一定的應用價值。這些研究成果爲我國研制基因工程HPV疫苗奠定了基礎。