多重PCR檢測急性非淋巴細胞白血病IgH及TCRVγΙ-Jγ基因重排①

　　免疫球蛋白重鏈(IgH)和T細胞受體(TCR)基因重排發生于造血幹細胞向淋巴系分化早期，其獨特的V-D-J重排可作爲B淋巴系和T淋巴系克隆的特異性基因标志，已被國内外較廣泛應用于淋巴系腫瘤的分型、微小殘留病的檢測及基因分型等研究。爲進一步了解急性非淋巴細胞白血病(ANLL)是否也存在上述兩種基因重排，采用多重PCR技術檢測41例ANLL病人IgH及TCRVγI-Jγ基因重排。

　　1　材料與方法

　　1.1　病例　經形态學、組織化學和免疫學确診的41例ANLL患者，年齡20～63歲，男性24例，女性17例。41例中ANLL FAB分型M1　1例，M2　12例，M3 7例，M4 8例，M5 10例，M6 2例，M7 1例。37例爲初發病人，4例爲緩解病人。

　　1.2　寡核苷酸引物選擇 利用計算機輔助設計分别對IgH、TCRγ鏈V區和J區共同保守序列的引物，遵循PCR引物設計的原則，保證每條引物及4條引物間無互補結構，引物間Tm值相近，兩者擴增後分别在400和110 bp出現陽性擴增帶，電泳後較易鑒别。引物序列如下：VH：5′-ACACGGCCGTGTATATCTGT-3′；JH：5′-ACCTGAGGAGACGGTGACC-3′；VγI：5′-TCTTCCAACTTGGAAGGGAGA-3′;Jγ：5′-CCCTCTATTACCTTGGAAATG-3′。所有引物均由上海細胞生物所合成。

　　1.3　DNA樣本的提取　用淋巴細胞分離液分離單個核細胞，參照文獻［1］應用0.45%NP40-蛋白酶K法提取DNA。

　　1.4　多重PCR擴增　多重PCR擴增IgH和TCRVγI-Jγ重排，引物方面采用計算機輔助引物設計，通過不斷改變Mg離子濃度和退火溫度，優化循環參數及條件而建立。20 μl反應體積加入2 mmol/L dNTP 2 μl，10×PCR　Buffer　2 μl，25 mmol/L MgCl2 1.5　μl，IgH及TCRγ鏈引物各10　pmol，95℃預變性後加入Taq酶1.5　U，循環條件爲94℃變性1 min，55℃退火40 s，72℃延伸40 s，5個循環後改爲94℃變性40 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s共25個循環，最後72℃延伸10 min。取6　μl　PCR産物在2.5%瓊脂糖凝膠，1×TBE液中電泳，溴化乙錠染色10 min，紫外燈下觀察結果。爲避免實驗結果存在假陰性和假陽性，所有被檢标本于檢測同時均設置陽性對照和雙陰性對照(含正常人DNA陰性對照和隻缺模闆核酸的試劑陰性對照)，并在檢測過程中，嚴格遵守PCR操作規則，确保檢測結果的可靠性。

　　2　結果

　　2.1　ANLL患者基因重排的檢測結果　IgH基因重排陽性的病例經PCR擴增後在110 bp上下可發現特異性重排帶，TCRVγI-Jγ基因重排陽性病例在400 bp上下可出現特異性重排帶，IgH及TCRVγI-Jγ基因重排均陽性的病例則在110和400 bp上下各可發現一條特異性重排帶。41例ANLL患者經多重PCR擴增後3例發現單一IgH基因重排，5例發現單一TCRVγI-Jγ基因重排，3例(7.3%)則同時存在兩種基因重排(圖1)。IgH基因重排陽性率爲14.6%(6/41)，TCRVγI-Jγ基因重排陽性率爲19.6%(8/41)，IgH或TCR基因重排總陽性率爲26.8%(11/41)。ANLL病人中IgH基因重排和TCRVγI-Jγ基因重排陽性率無顯著差異(P＞0.05)。11例IgH或TCRVγI-Jγ基因重排陽性病例中9例爲初治病例，2例爲緩解期病人。

　　2.2　基因重排陽性病人的臨床預後　我們37例初治的ANLL病人經常規DA(柔紅黴素聯合阿糖胞苷)或HA(三尖杉酯鹼聯合阿糖胞苷)方案治療後轉歸情況，結果顯示9例基因重排陽性初治ANLL病人僅3例(33.3%)獲完全緩解(CR)，而28例基因重排陰性ANLL病人經上述方案治療後CR率爲75.0%(21/28)。基因重排陽性ANLL治療CR率低于重排陰性ANLL(P＜0.05)。2例緩解期檢測基因重排陽性病人分别于檢測陽性後3個月和9個月出現形态學複發，而2例基因重排陰性的緩解期病人，1例CR 15個月後複發，而另一例爲M3患者，經自體骨髓移植術後已持續緩解53個月。

　　2.3　微小殘留病的檢測　在41例ANLL病人标本中，有2例是處于CR期的病人，亦檢測出基因重排陽性。對此2例病人觀察發現，其在檢測陽性3個月和9個月後發現臨床和骨髓相複發。另2例初治具有基因重排陽性ANLL病人，雖經DA方案治療後獲CR，但在緩解期中，此2例病人标本經PCR擴增後仍持續發現基因重排陽性。此2例病人分别于緩解後5個月和6個月出現形态學和臨床複發。從而提示重排基因的檢測在ANLL的微小殘留病研究中也有一定意義。

　　3　讨論

　　以往認爲IgH基因重排僅發生于B淋巴細胞系腫瘤，TCR基因重排則爲T淋巴系腫瘤的特異性基因标志。但近年來研究表明，IgH和TCR基因重排也可發生在其他分化序列的細胞上，如T細胞急性淋巴細胞白血病(ALL)可出現IgH基因重排，B-ALL也可發生TCR基因重排，這一現象又稱序列失真(Lineage　infidelity)現象，目前認爲該現象産生是由于Ig和TCR基因既具有同源性，又有相同的重組酶，在早期淋巴細胞分化中，可能缺乏嚴格界線，當細胞分化時，Ig與TCR重組酶處于活化階段，當發生重排的調節機制異常時，同一的重排酶可将兩個基因錯誤進行重排［2，3］。本研究結果顯示3例ANLL病人同時存在IgH和TCRVγI-Jγ基因重排現象可能也與調節機制異常導緻同一重排酶錯誤将兩個基因同時進行重排有關。

　　随着分子生物學技術進展，白血病的分型研究由單純形态學發展至MIC(形态學、免疫學和遺傳學)及基因分型水平。國外有文獻報道應用Southern雜交技術可發現部分ANLL病人存在IgH或TCR基因重排。我們應用多重PCR技術檢測41例ANLL患者IgH及TCRVγI-Jγ基因重排，結果顯示26.8%ANLL病人存在IgH或/和TCRVγI-Jγ基因重排，進一步證實IgH和TCR基因重排不僅發生于淋巴系腫瘤，也可發生部分ANLL病人，故檢測IgH或TCR基因重排進行分型時，單純IgH或TCR基因重排陽性并不能确定爲淋巴系，而須結合形态、組化和免疫學等檢查綜合分析。關于部分ANLL病人也發生IgH或TCR基因重排的機制，目前認爲，這部分病人的白血病起源于較早期多潛能幹細胞或淋髓前體細胞水平，它可同時表達幾種序列的标志，随着細胞的定向分化，這種重排仍然存在［3］；此外，在部分ANLL病人中，除髓系白血病主克隆外，可能還存在着淋巴系的寡克隆［4］。臨床上存在的系列轉變現象，如起病時爲ANLL經治療緩解後複發卻表現爲ALL，也從一側面支持這一觀點，此機制尚需進一步研究。

　　我們結果還顯示具有TCRVγI-Jγ基因重排ANLL臨床治療緩解率低于重排陰性ANLL，其機理尚不明确，可能與這類病人白血病克隆起源于較早期幹細胞或前體細胞水平有關，也可能與基因重排陽性ANLL病人例數少及随機性有關，尚待擴大病例數進行觀察。1例緩解期及2例治療後緩解期病人可檢測出TCRVγI-Jγ基因重排，且此3例病人均于半年内出現臨床和形态學複發，說明應用PCR技術檢測髓系白血病TCRVγI-Jγ重排基因也可應用于微小殘留病的監測和早期預測複發的研究。

　　應用多重PCR技術可以一次PCR循環同時擴增IgH和TCR基因重排，對基因重排的檢出率高于單獨檢測單個基因重排；而與分别擴增的方法比較，多重PCR技術可減少加樣次數，降低污染；減少Taq酶、dNTP和DNA标本用量，降低費用；簡化操作步驟，提高工作效率等優點，更适合臨床檢測需要。