IgH、TCRδ基因重排與急性非淋巴細胞白血病的相關性

　【摘要】　目的　探讨初診急性非淋巴細胞白血病(ANLL)患者中免疫球蛋白重鏈(IgH)和T細胞受體δ鏈(TCRδ)基因重排情況。方法　用聚合酶鏈反應方法檢測IgH及TCRδ基因重排。結果　30例患者中9例(30%)發生IgH基因重排，5例出現TCRδ基因重排。結論　ANLL中确實存在系列不保真現象：不僅具有較高的IgH重排發生率，還具有TCRδ重排發生。

　　目前認爲，當多能造血幹細胞向淋巴細胞系定向分化時可發生免疫球蛋白重鏈(IgH)、T細胞受體(TCR)基因特異性重排，因此，重排的IgH、TCR基因可作爲淋巴細胞克隆标志。然而，上述特異性重排發生在急性非淋巴細胞白血病(ANLL)中的報道已陸續出現［1-5］。但初診患者中的發生率及其相關臨床意義仍有待進一步研究。我們用聚合酶鏈反應(PCR)方法對30例初診ANLL患者進行了IgH、TCRδ基因重排的檢測，并就相關問題作了探讨。

病例和方法

1　病例　經形态學和免疫學确診的ANLL患者30例，FAB分型中M16例，M26例，M312例，M42例，M53例，M61例。均爲初診患者。

2　免疫分型采用細胞間接免疫熒光進行标記，Epics XL型流式細胞儀(Coulter, USA)檢測。所用單克隆抗體T系列爲CD2、CD3、CD7；B系列爲CD10、CD19、CD22；髓系系列爲CD13、CD14、CD33；幹/祖細胞抗原爲CD34。均購自Immunotech公司。第二抗體爲異硫氰酸熒光素(FITC)标記的羊抗鼠免疫球蛋白，購自軍事醫學科學院。結果判定：CD34細胞陽性率>10%爲陽性指标，其餘抗原陽性細胞>20%爲陽性标準。

3　寡核苷酸引物選擇　根據PCR引物設計原則，參考文獻［4，6］設計如下引物：①針對IgH CDR-Ⅲ區域、Ⅴ區和J區的共同保守序列的引物A和B，引物序列：A：5′-ACACGGCCGTGTATTACTGT-3′；B：5′-ACTCTAGAGGAGACGGTGACC-3′。②針對TCRδ基因重排所産生的DNA片段，引物序列爲：A：5′-GTGTGTATTTGTGGCCTTCAGCTAC-3′；B：5′-AAATGCTAGCTATTTCACCCA-3′。以上引物均由上海Sagon公司合成。

4　标本來源爲骨髓細胞。DNA提取見文獻［7］。

5　PCR反應及産物檢測　反應體系爲50μl，Taq DNA聚合酶2.0U(Sagon),0.5μg DNA模闆，100mmol/L dNTP，引物各100ng。針對IgH的PCR反應條件爲94℃ 30s,56℃ 45s,72℃　105s，共32個循環［5］。針對TCRδ基因重排的PCR條件爲94℃ 60s，56℃ 60s， 72℃ 120s，共35個循環［6］。取擴增産物6μl，20g/L瓊脂糖凝膠，TAE電泳，EB染色，紫外燈下觀察結果。

結果

1　IgH重排　30例患者中9例PCR檢測陽性，陽性率爲30.0%。PCR特異性産物約爲110bp，不同個體間産物亮度略有差異，且較急性淋巴細胞白血病(急淋)陽性标本爲弱。陽性标本在FAB分型中的分布爲M12例，M22例，M34例，M51例。

2　TCRδ重排　30例患者有5例出現特異性陽性區帶，片段大小約190bp。FAB分型：M12例，M2　2例，M31例。

3　30例患者中随訪16例(M12例，M23例，M39例，M41例，M51例)，其中4例IgH陽性；1例TCRδ陽性；1例M1IgH、TCRδ雙陽性。 除M3用全反式維甲酸誘導緩解外，餘均用以柔紅黴素(30～60mg/m2)、阿糖胞苷(100～200mg/m2)爲主的DA方案誘導緩解。按照目前臨床普遍接受的标準：兩個療程以上強烈化療未獲緩解即爲難治性白血病［8］，6例陽性患者中，隻有1例雙陽性者爲難治性白血病；10例陰性者中2例達到這一标準。

4　30例患者中出現淋系相關抗原的有6例。它與FAB分型及IgH/TCRδ重排間的關系見表1。

讨論

　　白血病分型已從一般形态學和免疫學分型進入基因分型。通過設計引物擴增IgH基因重排産生的CDR-Ⅲ序列和TCR基因重排序列，可作爲臨床診斷急性淋巴細胞白血病惡性增殖的指标。但近來發現，IgH和TCR基因重排也可在其它分化系列的細胞上出現，如Rovigatti等［1］在ANLL 14例中利用Southern雜交發現2例具有IgH基因重排，此即系列不保真(lineage infidelity)［9］。最近有文獻報道，利用PCR方法也發現了ANLL中出現IgH基因重排和TCRγ基因重排，但各家報道不一。陳冬梅等［3］在17例初診ANLL患者中發現2例，徐兵等［4］在29例初診ANLL患者中發現4例IgH基因重排，我們利用Kyoda等［5］設計的反應條件，對30例ANLL患者進行了IgH的PCR檢測，結果不僅證明IgH重排并不局限于淋巴系統腫瘤，同時發現其在ANLL中的表達可能遠高于文獻的報道，達到了30%，而Kyoda等則達到了40%(共35例)，說明随着檢測手段的改進以及靈敏度的提高，這種系列不保真現象的發生率可能較目前所知的更高。

表1　出現陽性的淋系相關抗原與FAB分型及IgH/TCRδ
重排的關系

出現陽性的
淋系相關抗原 例數 FAB分型 基因重排
　　CD2 2 M3 IgH
　 　 M5 (-)
　　CD7 2 M1 IgH及TCRδ
　 　 M1 (-)
　　CD2、CD7 1 M2 TCRδ
　　CD19 1 M2 TCRδ

　　關于TCR基因重排在非淋巴細胞白血病中發生的現象，Schmist等［2］曾對ANLL 100例進行的Southern分析發現9例具有TCR基因重排，陳冬梅等［3］利用PCR方法在17例初診患者中發現了3例具有TCRγ基因重排。我們利用該法對初診ANLL患者30例TCRδ的基因重排進行了檢測，結果發現5例陽性，與陳冬梅等TCRγ基因重排的檢出率基本相同。

　　如何解釋這種系列不保真現象，各家說法不一。多數學者認爲，可能惡性克隆最初發生在多能幹細胞階段，但腫瘤本身更促使變化了的多能幹細胞向髓系定向發展，因此從形态學角度，細胞仍以髓系特點爲主。Greaves等［9］對他及其它研究小組發現的淋、髓兩系中系列不保真現象進行總結，認爲在排除技術因素後，那些确實具有系列不保真現象的标本，不是因爲細胞内基因發生了錯排，而是因爲正常多能幹細胞中本身存在着短暫的基因表達混雜現象(promiscuity)，上述患者中，由于成熟障礙緻使原始的白血病細胞保留了上述混雜現象的痕迹。從30例ANLL患者的免疫表型也可看出，這些患者有6例出現了淋巴細胞系相關抗原。當然，值得注意的是，這種免疫表型的“不保真性”與IgH/TCRδ重排間并無明顯的相關性，其原因有待進一步了解。

　　上述系列不保真現象是否具有一定的臨床意義針對可随訪的16例患者所做的治療效果分析未顯示出統計學差異(P=0.5)。但觀察例數較少。同時，治療方案的不同(如M3多使用全反式維甲酸治療，餘病例則用ANLL相關的化療方案)也掩蓋了患者白血病細胞生物學特性的差異。值得注意的是：僅1例IgH、TCRδ雙陽性患者表現出明顯的難治性白血病特點，我們在另一組慢性粒細胞白血病患者中發現1例患者具有IgH重排，其在接受異基因造血幹細胞移植後6個月以急淋變的形式複發。Kyoda等［5］對35例ANLL的觀察也提示IgH重排陽性組較陰性組生存期長(P=0.2)。還有文獻報道在ANLL緩解期中發現IgH重排的出現并可預測微小殘留病變［3，4］。這些結果均表明系列不保真現象的臨床價值不容忽視。

　　總之，作爲B、T急淋基因分型的重要标志的IgH、TCR基因重排确實存在系列不保真現象。一方面，它提示我們IgH、TCR基因重排可能不宜作爲ALL的絕對指标。同時，它爲分子水平的雜合性白血病的診斷提供了依據。另外，在理論上，它也爲研究白血病在造血細胞分化階段的發生提供了新的資料。